Anterior gradient protein 2 homolog (AGR2），前梯度蛋白 2，是一種分泌或定 位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白，主要表達(dá)于氣管、肺、胃、小腸、結(jié)腸和前列腺等組織中， 其作用主要與粘蛋白 (Mucin 2）的合成與分泌相關(guān)，因此該蛋白在腫瘤相關(guān)研究 中受到較大重視。Cloud-Clone Corp. 公司針對該蛋白研制出了蛋白、抗體和 ELISA 檢測試劑盒等一系列相關(guān)檢測工具，供相關(guān)研究者使用。

由于 AGR2 蛋白是一個(gè)只有 175 個(gè)氨基酸的蛋白，通過抗原表位及功能結(jié)構(gòu) 域的分析，我們選取了去掉信號肽的全長蛋白序列（Arg21~Leu175）作為免疫原 的序列，這樣不僅在免疫原的角度使該蛋白包含 AGR2 的所有抗原表位，同時(shí)選 取全長序列也可以方便對該蛋白研究有需求的研究者進(jìn)行蛋白水平的研究。依據(jù) uniport 中 O95994 所對應(yīng)的蛋白及核酸序列設(shè)計(jì)引物如下，引物分別含有一個(gè) EcoRI 的酶切位點(diǎn)和一個(gè) XhoI 的酶切位點(diǎn)，用于后期重組載體的構(gòu)建：

[ PRIMER INFORMATION ]

Upstream Primer: CGGAATTCAGAGATACCACAGTCAAACCTGGAG

Downstream Primer: CCGCTCGAGTTACAATTCAGTCTTCAGCAACTTG

完成引物設(shè)計(jì)后，通過模板對該蛋白的基因進(jìn)行了克隆，PCR 獲得一個(gè) 片段大小約為 450bp 的 DNA 片段。測序正確后，采用傳統(tǒng)的雙酶切法與 Cloud-Clone Corp.自主構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)載體 pUSCNK-1 進(jìn)行連接，并用 于后期的蛋白表達(dá)，測序結(jié)果如圖 1 所示。

圖1 pUSCNK-1 AGR2 測序結(jié)果

獲得測序結(jié)果后，將其與 NCBI 序列比對發(fā)現(xiàn)，其與人 AGR2 的相似性為 100%，從而證明了擴(kuò)增序列的正確性，序列比對結(jié)果如圖 2。

圖 2 核酸序列比對結(jié)果

此后，將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，獲得一個(gè)大 小約為 17KDa 的重組蛋白，由于表達(dá)蛋白連接有 His 標(biāo)簽，后期純化采用了鎳柱 純化的方法，獲得純化的重組蛋白 AGR2（貨號 RPC285Hu01），如圖 3 所示。

然后，用該蛋白免疫小鼠制備出小鼠抗人 AGR2 的單克隆抗體，并采用親和 層析的方法獲得高特異性的純化抗體（貨號 MAC285Hu21），同時(shí)免疫兔獲得兔抗 人 AGR2 的多克隆抗體（貨號 PAC285Hu01）。

獲得純化抗體后，通過 Western Blot 和 IHC 等方法對其質(zhì)量進(jìn)行了一系列檢 測，結(jié)果如圖 4、5 所示。在 Western Blot 中，我們檢測了人結(jié)腸、小腸、胃組織 樣本，結(jié)果顯示為陽性，而大鼠肌肉組織樣本結(jié)果顯示為陰性，這樣就驗(yàn)證了AGR2 表達(dá)的特異性。

此后，我們對純化的單克隆抗體（貨號 MAC285Hu21）進(jìn)行了 FITC 標(biāo)記， 獲得標(biāo)記的抗人 AGR2 蛋白的抗體（貨號 MAC285Hu81），并用人胃癌組織進(jìn)行 了 IHC 檢測，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果如圖 6 顯示。結(jié)果顯示在人胃癌組織中有強(qiáng) 烈的熒光信號，且信號主要集中于胞漿中，從而證明了標(biāo)記抗體的特異性和 FITC 標(biāo)記的效率。

同時(shí)，在獲得蛋白和抗體后，Coud-Clone Corp.還研制出相應(yīng)的 AGR2 蛋白定 量檢測試劑盒（貨號 SEC285Hu）。

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