Western Blot 是一種常用的初步檢測基因表達(dá)產(chǎn)物正確與否的實驗方法，同時 它也多用于比較不同樣本中蛋白表達(dá)量的差異。但是由于 Western Blot 是一種包含 多個實驗步驟和多種試劑的系統(tǒng)實驗，所以當(dāng)遇到結(jié)果與預(yù)期不同的情況時，特別 是：全陰性結(jié)果，假陽性結(jié)果時，對于這類結(jié)果出現(xiàn)的原因進(jìn)行分析也是十分繁瑣 的一件事情?；诖耍粋€嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?Western Blot 實驗一般都需要設(shè)計一種合適的參 照體系，這樣便于對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。常見的參照體系包括多種參照物，例如： 分子量 marker，空白載體對照，陰、陽性對照樣本，內(nèi)參等等，其中內(nèi)參在結(jié)果 分析中起到至關(guān)重要的作用。

內(nèi)參（Internal Control）是指試驗系統(tǒng)的內(nèi)部參照，一般對于哺乳動物細(xì)胞表 達(dá)系統(tǒng)來說是指由看家基因（house keeping gene）編碼表達(dá)的蛋白，他們在各種不 同組織和細(xì)胞中的表達(dá)都相對恒定，在實驗中檢測蛋白表達(dá)水平時，將該蛋白作為 一種參照物，可用于確定樣本使用量（組織量，細(xì)胞量，上樣量等）的一致性，以 及校正實驗過程中可能出現(xiàn)的操作誤差，以進(jìn)一步保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。所以在 展示 Western Blot 實驗結(jié)果時，內(nèi)參數(shù)據(jù)的提供是十分重要的。

現(xiàn)在實驗中常用的內(nèi)參蛋白包括：細(xì)胞骨架蛋白 beta-actin，beta-tubulin， GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）等。一般為了便于分辨目的蛋 白分子和內(nèi)參，建議這兩者間的分子量相差大于 5kD。

Actin 是肌動蛋白，一種重要的細(xì)胞骨架蛋白，他共分為 6 種亞型，包括： alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin 和 gamma-smooth muscle actin、beta-actin (β-non-muscle)和 gamma-non-muscle actin， 其中前 4 種是組織特異性的，而后兩種廣泛分布于各種組織中。但是常用作 Western Blot 內(nèi)參的 beta-actin（分子量約 42kd）實際上在肌肉組織中的分布很少，所以如 果選用 beta-actin 特異性的肽段（如：N-端肽段）作為免疫原制備的抗體可能在肌 肉組織中就不能得到陽性信號，而用 beta-actin 中與其他 actin 序列同源性高的肽段 作為免疫原制備的抗體就能在包括肌肉組織在內(nèi)的多種組織中檢測到陽性信號，而 可作為一種廣泛可用的內(nèi)參對照。與 abcam 和 sigma 常用的 N 段或者 C 端肽段制 備抗體不同的是，Cloud-Clone Corp.制備的 beta-actin 內(nèi)參抗體 PAB340Mi 是基于 該蛋白的全長序列的，經(jīng)過 Western Blot 顯示：該抗體可以識別包括心肌組織在內(nèi) 的多種組織中的 beta-actin，同時由于該蛋白在不同物種中的高度保守性，所以可 用于多物種樣本的內(nèi)參蛋白識別。

圖 1 PAB340Mi 使用于不同組織中的 Western Blot 圖

Tubulin 即微管蛋白，同樣是一種重要的細(xì)胞骨架蛋白。Tubulin 分為 alpha、 beta、gamma、delta，epsilon 等多種亞型，由于其中的 beta-tubulin（分子量約 50kd） 具有與 beta-actin 類似的特點，所以也多用作 Western Blot 內(nèi)參，Cloud-Clone Corp. 制備的 beta-tubulin 內(nèi)參抗體 PAB870Mi01 同樣可作為多物種樣本的內(nèi)參抗體用于 Western Blot 實驗中。

GAPDH，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，是參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶，其分子量約 36kd，也是一種常用的內(nèi)參蛋白，Cloud-Clone Corp.研發(fā)的該內(nèi)參抗體 PAB932Hu01  lane 10 kidney lane 11 spleen lane 12 liver lane 13 lung lane 14 brain lane 15 heart 和 PAB932Hu02，其免疫原分別為含有 Gly2~Ser148 和 Thr154~Val324 兩段序列的 重組蛋白，均可以用作 Western Blot 實驗中的內(nèi)參抗體。使用該蛋白作為內(nèi)參時還 需注意一點：由于組織缺氧、糖尿病等因素會導(dǎo)致 GAPDH 的表達(dá)增高，在使用該 類組織細(xì)胞樣本時，不適合使用 GAPDH 做為內(nèi)參。

而針對細(xì)胞核內(nèi)參，Cloud-Clone Corp.也研發(fā)制備了抗組蛋白 Histone H3 和增 殖細(xì)胞核抗原 PCNA 的抗體，PAA285Mi01 是針對染色體組成型表達(dá)的 H3 蛋白的 特異性抗體，PAA591Mi01 是針對細(xì)胞核內(nèi)合成的 PCNA 蛋白的抗體，已被多位研 究工作者用作核內(nèi)參抗體。

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