自上世紀 70 年代問世以來，酶聯(lián)免疫吸附測定作為一種簡便、快速的微量 蛋白的定量測定方法，已廣泛應用于生物學和醫(yī)學的許多領域。

酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）是將 抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記結(jié)合的一種新型的免疫測定技術 。 其可分為以下四大類：直接 ELISA、間接 ELISA、夾心 ELISA 和競爭抑制 ELISA。 而其中，最廣泛用于目標抗原或抗體的定量檢測方法就是雙夾心 ELISA（Double Sandwich ELISA），其通過將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，通過待測 抗原與包被抗體反應，接著加入酶反應的底物，將底物催化成有色產(chǎn)物，最后 根據(jù)呈色的深淺進行定量分析。

作為一種高靈敏度的定量檢測手段，雙夾心 ELISA 需要通過將樣品的吸光 度值代入相應的標準曲線后才可確定終濃度。因此，標準曲線的繪制和擬合對 于實驗的成功與否至關重要。而對于初學者來說，面對眾多的 ELISA 數(shù)據(jù)分析 軟件（如 EXCEL、SPSS、CurveExpert、Origin 等等），往往不知如何選擇和使 用。由于 EXCEL 是其中科學工作者日常最普遍的軟件之一，因此接下來我們將 以此為例，具體介紹一下典型的雙夾心法標準曲線的擬合步驟。

我們選用了 Cloud. Clone 公司的 SEA079Ra，ELISA Kit for Interleukin 6 (IL6)的一次質(zhì)檢標準品吸光度值作為參考，如圖 1 所示，實驗人員從最高 100 pg/mL 濃度的標準品（H1 孔），經(jīng)倍比稀釋至 1.56 pg/mL 濃度（B1 孔），陰性對 照孔為標準品稀釋液（第 A1 孔）。

首先，將各孔的吸光度值減去陰性對照孔吸光度值（本底），得到校正后的 吸光度值（如圖 2 所示），接著，以校正后的吸光度值為 x 軸（Optical Density）， 相應的標準品濃度為 y 軸（Concentration (pg/mL)，作 XY 散點圖(如圖 3 所示 的綠色突出顯示部分)，得到一條 7 點曲線。（此類曲線一般為直線、近似直線 或 S 型（如圖 3 所示）。

接著，在該曲線中任選一點以右鍵打開，選擇”添加趨勢線(R)”，圖表上 便會彈出一個對話框。當目測標準曲線為直線或近似直線時，則可在“類型” 選項中選擇“線性(L)”，而當目測標準曲線為 S 型時，則可在“類型”選項中 選擇“多項式(P)”并將“階數(shù)(P)”設定為 2 階。最后，在“選項”中勾選“顯 示公式(E)”和“顯示 R 平方值(R)”（如圖 4 所示），點確定，便會出現(xiàn)標準曲 線的對應公式及 R 2值（如圖 5 所示）。

在了解了標準曲線的繪制方法之后，我們?nèi)绾闻袛嘁粭l標準曲線是否良好 呢？一般而言，一條好的標準曲線應具備以下三點：

1）陰性對照孔 OD 值小于 0.25；

2）R²值大于 0.95，越接近 1 越好；

3）最高濃度孔的標準品吸光度值應至少大于 0.8。

最后，我們將繪制和分析標準曲線過程中常見的問題及相應的解決方案總 結(jié)如下：