ELISA 實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)者經(jīng)常會(huì)遇到樣本測值低的問題，樣本類型包括血清、 血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液等。假設(shè)客戶的操作完全正確，標(biāo)準(zhǔn)曲線良好， 這種情況樣本測值低可從兩方面進(jìn)行分析：一是樣本本身含量可被檢測，但由 于實(shí)驗(yàn)操作等原因?qū)е聵颖緶y值不在試劑盒檢測范圍內(nèi)；二是分析物在樣品中 本身濃度偏低。下面將從這兩個(gè)方面來進(jìn)行分析導(dǎo)致樣本測值低的因素以及對(duì) 應(yīng)的解決方案。

1.樣本本身含量可以被檢測，有哪些原因?qū)е聹y值低呢？

1）試劑盒的保存

試劑盒要按照規(guī)定的方法保存，實(shí)驗(yàn)者在購買試劑盒時(shí)請(qǐng)務(wù)必留心試劑盒 不同組分的保存方法。如優(yōu)爾生的試劑盒建議檢測液 A、檢測液 B、標(biāo)準(zhǔn)品以及 酶標(biāo)條等儲(chǔ)存在-20 度，而其它標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液等儲(chǔ)存在 4 度。

2）樣本上樣前的準(zhǔn)備

這個(gè)過程包括樣本的制備、保存以及是否有經(jīng)歷過反復(fù)凍融。樣本的制備 要根據(jù)樣本類型采用不同的方法，血清、血漿與細(xì)胞裂解液的制備方法均不同。 保存，包括保存溫度以及保存時(shí)間。一般推薦樣本制備后進(jìn)行分裝后儲(chǔ)存在-20 度或-80 度，儲(chǔ)存時(shí)間不宜過久，因?yàn)殚L時(shí)間的儲(chǔ)存有可能導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的降解， 致使檢測結(jié)果不理想。最后注意不要反復(fù)凍融，蛋白樣本反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致降解 發(fā)生。

3）稀釋方案

樣本的稀釋對(duì)于實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要，稀釋過度以及稀釋不足均有可能導(dǎo) 致樣本的測值低。

稀釋過度：一般情況下客戶都會(huì)根據(jù)文獻(xiàn)測值，以及檢測范圍估計(jì)一個(gè)稀 釋倍數(shù)，優(yōu)爾生的試劑盒在出廠之前也會(huì)做大量檢測，對(duì)于常規(guī)樣本如血清血 漿，我們也會(huì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室樣本測值情況推薦一個(gè)稀釋倍數(shù)。但實(shí)驗(yàn)者如果直接 按照估計(jì)或推測的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋檢測后，發(fā)現(xiàn)樣本 OD 非常低。這是由于文 獻(xiàn)作者用的樣本，優(yōu)爾生實(shí)驗(yàn)用的樣本與實(shí)驗(yàn)者的樣本會(huì)存在一定的差異，這 些測值有一定的參考意義，但如果照搬，可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。所以建議實(shí)驗(yàn) 者在正式試驗(yàn)前是先做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定樣本的有效性以及最佳稀釋倍數(shù)。預(yù)實(shí)驗(yàn)， 可參考文獻(xiàn)，將樣本進(jìn)行梯度稀釋，最后選取樣本 OD 落在標(biāo)準(zhǔn)曲線中間位置的 點(diǎn)的稀釋倍數(shù)。

稀釋倍數(shù)不夠：鉤狀效應(yīng)，Elisa 實(shí)驗(yàn)中發(fā)生鉤狀效應(yīng)主要是當(dāng)抗原與抗體 比例不合適而導(dǎo)致假陰性的現(xiàn)象，抗原過量稱為后帶效應(yīng)。當(dāng)樣本中目標(biāo)物含 量很高，而沒有進(jìn)行正確的稀釋，就有可能會(huì)導(dǎo)致假陰性反應(yīng)。解決方案依舊 同稀釋過度的解決方案一樣，在正式實(shí)驗(yàn)之前做預(yù)實(shí)驗(yàn)。

2.分析物在樣品中本身濃度偏低

很多時(shí)候，客戶操作沒有問題，標(biāo)準(zhǔn)曲線良好，但檢測多次樣本依然不在 檢測范圍。像細(xì)胞因子，如 IL-6 需在炎癥刺激情況才會(huì)大量產(chǎn)生，一般非炎癥 樣本測值會(huì)非常低。針對(duì)這種測值比較低的情況，一般建議根據(jù)文獻(xiàn)選取適合 的樣本類型，同時(shí)可以選用高靈敏度的試劑盒，優(yōu)爾生針對(duì)某些容易出現(xiàn)測值 低的指標(biāo)都有研發(fā)出高靈敏度的試劑盒，如 IL-6 等。

以上就是實(shí)驗(yàn)者在實(shí)驗(yàn)過程會(huì)遇到的樣本測值低的部分原因，以及一些分 析以及解決方法。當(dāng)然，具體問題還需具體分析。成功的 Elisa 實(shí)驗(yàn)依賴于質(zhì) 量過硬的試劑盒，恰當(dāng)處理的樣本以及良好的操作技能。

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