眾所周知，對(duì)于具有多個(gè)表位的抗原而言，雙夾心 ELISA（Double Sandwich ELISA）可應(yīng)用于目標(biāo)抗原或抗體的定量檢測(cè)。而對(duì)于小分子抗原或半抗原，因缺 乏可作夾心法的兩個(gè)以上的結(jié)合位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定。此時(shí)， 可以采用競(jìng)爭(zhēng)抑制法模式來(lái)檢測(cè)其中靶分子的含量。競(jìng)爭(zhēng)抑制 ELISA 又叫封閉 ELISA，其主要原理是將標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。 標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺，也就 是說(shuō)，最終顯色的結(jié)果與待檢抗原或抗體的干擾程度成負(fù)相關(guān)。小分子激素、藥物 等 ELISA 測(cè)定多用此法。

對(duì)于很多習(xí)慣了雙夾心法ELISA檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)人員而言，在面對(duì)競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA 數(shù)據(jù)時(shí)常常會(huì)遇到不知如何分析的問(wèn)題，上次我們已就經(jīng)典的雙夾心 ELISA 標(biāo)準(zhǔn) 曲線的繪制和擬合進(jìn)行了詳細(xì)講解（雙夾心法標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方法），因此，接下 來(lái)我們將以 Cloud. Clone 公司的 CEA924Ge，氰鈷胺素(CNCbl)檢測(cè)試劑盒的一次 質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值為例，詳細(xì)地介紹一下用 EXCEL 軟件進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制 ELISA 標(biāo) 準(zhǔn)曲線的擬合步驟。

如圖 1 所示，實(shí)驗(yàn)人員從最高 10000 pg/mL 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（第 F1 孔），經(jīng)倍 比稀釋至 123.5 pg/mL 濃度（第 B1 孔），陰性對(duì)照孔為單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（第 A1 孔），可以看出對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)抑制 ELISA 法來(lái)說(shuō)，一般而言陰性對(duì)照孔的吸光度值 最大。

與雙夾心法 ELISA 不同的是，競(jìng)爭(zhēng)抑制 ELISA 的標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值并不需要減 去陰性對(duì)照孔的本底吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)品的各孔吸光度值為 x 軸，標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)濃度 取 Log10 后的值(如圖 2 所示的綠色突出顯示部分)為 y 軸作 XY 散點(diǎn)圖，得到一條 5 點(diǎn)曲線，其中 X 軸為吸光度（Optical Density），Y 軸為濃度的對(duì)數(shù)值（Log. of Concentration），如圖 3 所示。

接著，在該曲線中任選一點(diǎn)以右鍵打開，選擇”添加趨勢(shì)線(R)”，圖表上便 會(huì)彈出一個(gè)對(duì)話框。在“類型”選項(xiàng)中選擇“多項(xiàng)式(P)”并將“階數(shù)(P)”設(shè)定為 2 階。最后，在“選項(xiàng)”中勾選“顯示公式(E)”和“顯示 R 平方值(R)”（如圖 4 及圖 5 所示），點(diǎn)確定，便會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)應(yīng)公式及 R2 值（如圖 6 所示）。

圖 3 標(biāo)準(zhǔn)曲線示例圖

圖 4. 添加擬合公式的過(guò)程示意圖

圖 5 典型帶擬合公式的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖

 在了解了競(jìng)爭(zhēng)抑制 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法之后，我們?nèi)绾闻袛嘁粭l標(biāo)準(zhǔn) 曲線是否良好呢？一般而言，合格的競(jìng)爭(zhēng)抑制 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)具備以下三點(diǎn)：

1. 標(biāo)準(zhǔn)品濃度越高，則得到的吸光度值越低，即樣品中分析物濃度與吸光度 呈負(fù)相關(guān)；

2. R2值應(yīng)至少大于 0.95，并且越接近 1 越好；

3. 陰性對(duì)照孔的吸光度值應(yīng)大于 0.8。

接下來(lái)，我們將繪制和分析競(jìng)爭(zhēng)抑制 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線過(guò)程中常見的問(wèn)題及相 應(yīng)的解決方案總結(jié)如下：

表 1. 競(jìng)爭(zhēng)抑制 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的常見問(wèn)題及解決方案