分子克隆構(gòu)建載體的最終目的是能夠?qū)⒛康牡鞍妆磉_(dá)出來，常見的表達(dá)系 統(tǒng)有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，酵母表達(dá)系統(tǒng)，昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，植物表達(dá)系統(tǒng)以 及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、操作簡(jiǎn)單、 產(chǎn)量高、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)，是最常用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。重組蛋白的分離純化 是蛋白，抗體，Elisa 試劑盒研發(fā)與制備的基礎(chǔ)。常見的純化方法有離子交換層 析，親和層析，疏水作用層析，排阻層析，電泳等，但純化工作不僅要保證純 度，重復(fù)性，還要保證穩(wěn)定性并控制成本。以下將以 E.coli 表達(dá)的重組蛋白為例， 給大家介紹蛋白表達(dá)成功后的純化方法，以期對(duì)研究者蛋白純化提供一定的參 考指導(dǎo)。

由于 E.coli 表達(dá)的蛋白在某些情況下會(huì)形成包涵體，它們不溶于水，致密地 集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種情況要棘手得多，另一 種情況是得到可溶蛋白。下面我們會(huì)從可溶蛋白和包涵體蛋白兩個(gè)角度對(duì) E.coli 重組蛋白純化方法進(jìn)行了解。

1. 可溶蛋白，如果蛋白是可溶的，可直接破菌，加酶抑制劑，保證蛋白充 分釋放及不降解，然后選用固定化金屬螯合親和層析 IMAC 方法進(jìn)行純化。下 圖是采用 IDA 鎳柱進(jìn)行人 AQO10 重組蛋白純化的電泳圖：

圖 1 SDS-PAGE （human AQO10）

注：泳道 1 為純化前蛋白，泳道 2 為流穿液，泳道 3 為掛柱后洗滌下來的蛋白

由圖中可以看出，泳道 1 純化前的樣本雜帶多，說明樣本中所含雜蛋白多； 泳道 2 為蛋白純化的流穿液，雜蛋白與泳道 1 類似，但目標(biāo)蛋白的條帶更深了， 這是因?yàn)槟繕?biāo)蛋白的含量很高，洗脫下來的一些目標(biāo)蛋白就占了流穿的一部分； 但可以發(fā)現(xiàn)泳道 3 只有一個(gè)目標(biāo)蛋白的條帶，無其它雜帶，表明純化之后蛋白 的純度非常高，無雜蛋白。

2.對(duì)于包涵體蛋白，要分離包涵體、增加蛋白質(zhì)的溶解度、并去除其它雜蛋 白，核酸，細(xì)胞碎片，脂類等干擾，具體操作步驟原理如下：

1) 菌體重懸，破菌。向菌體中加入破菌液使菌體混懸，加入 Triton X-100 以及 EDTA，超聲破碎儀破菌。Triton 屬于去垢劑分步洗滌中的第一步洗滌， 可以洗滌掉一些脂溶性物質(zhì)同時(shí)增加細(xì)胞膜的通透系，提高破碎效率，EDTA 作為金屬蛋白酶螯合劑存在；

2) 去垢劑洗滌。這一步是為了溶解包涵體，沉淀加破菌液重懸，每管 中加入 Ttiton X-100，可進(jìn)一步去除雜質(zhì)，混合均勻后離心收集沉淀；

3) 高鹽洗滌。這一步可去除上步殘留物的干擾，沉淀加高鹽緩沖液重 懸，混合均勻后離心收集沉淀。同時(shí)該濃度鹽可屏蔽蛋白電荷相互作用，另 外可促進(jìn)破碎釋放的未斷裂的核酸的溶解，方便后步核酸去除的處理。

4) 變性劑洗滌。沉淀加 Tris ，Urea，β-ME 重懸，混合均勻后收集沉 淀。低濃度變性劑 urea 可洗滌掉一些低表達(dá)的雜蛋白，EDTA 仍作為金屬蛋 白酶螯合劑，β-ME 作為還原劑可使高度錯(cuò)配的蛋白結(jié)構(gòu)一定程度的舒展 開。

5) 變性劑溶解。沉淀懸浮于 10ml 的包涵體溶解液（20mM Tris，6M GdnHCl，2mM β-ME，PH8.0）中室溫靜置過夜。高速離心，收集上清。 高強(qiáng)度的變性劑使不溶性蛋白沉淀溶解，β-ME 使錯(cuò)配的二硫鍵打開，促進(jìn) 蛋白的溶解

6) 與可溶蛋白一樣，采用 IMAC 固相金屬離子親和層析純化變性充分 的重組蛋白。

圖 2 SDS-PAGE （AKA4 ag7854 rat APPBP2(28a)）

泳道 1 為為流穿液，泳道 2 為掛柱后洗滌下來的蛋白

蛋白會(huì)通過洗脫收集驗(yàn)證。由圖可以看出，包涵體蛋白的純化與可溶性蛋 白的純化效率都非常高。

蛋白純化之后，首先我們會(huì)通過 SDS-PAGE 對(duì)蛋白以及純度進(jìn)行一個(gè)初步 驗(yàn)證，同時(shí)通過 HPLC 對(duì)純度進(jìn)一步驗(yàn)證，保證純度大于 95%以上。

蛋白質(zhì)的純化方法主要是利用不同蛋白質(zhì)之間的相似性與差異，依據(jù)蛋白 之間的相似性可以去除非蛋白物質(zhì)，再根據(jù)蛋白質(zhì)的差異性將目的蛋白分離出 來。蛋白純化是一項(xiàng)非常復(fù)雜的工作，我們提供常規(guī) E.coli 表達(dá)的重組蛋白純化 方法供研究者參考。

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