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實(shí)驗(yàn)操作指南-免疫組織化學(xué)常見問題和解決方法

免疫組織化學(xué)技術(shù)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù),是指用標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng),對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)免疫檢測(cè)方法。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性和分子生物技術(shù)的敏感性等巧妙結(jié)合,借助顯微鏡的顯像和放大作用,在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等),是單一的靜止的形態(tài)學(xué)描述,上升到結(jié)構(gòu)、功能和代謝為一體的動(dòng)態(tài)觀察,為疾病的診斷、鑒別診斷和發(fā)病機(jī)制的研究提供了強(qiáng)有力的手段。

然而,要想得到一張高質(zhì)量的免疫組化染色切片也并非易事。由于切片制作和免疫組化染色過程均存在很多步驟或環(huán)節(jié),每一個(gè)步驟或環(huán)節(jié)都需要操作者嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件,否則可能會(huì)影響到最終結(jié)果?,F(xiàn)就試驗(yàn)中遇到得常見問題進(jìn)行分析總結(jié),給進(jìn)一步給出解決方案,希望能為幫助相關(guān)實(shí)驗(yàn)人員提供實(shí)驗(yàn)成功率。

表1.免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的常見問題及其解決方法

出現(xiàn)的問題可能的原因處理方法
1.染色陰性

試劑失效

漏加試劑

試劑加入順序顛倒

重新試驗(yàn),設(shè)立陽性對(duì)照
組織中無目的抗原表達(dá)或表達(dá)量太低查閱文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫,確定組織中確有目的蛋白強(qiáng)表達(dá)。設(shè)立陽性對(duì)照片,以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果
一抗與二抗種屬不匹配

仔細(xì)確定一抗與二抗種屬無誤,如果一抗來源于兔,則二抗需選擇抗兔二抗,

了解一抗的類型,如果一抗是小鼠IgG1,那么二抗應(yīng)選擇抗小鼠IgG1。

抗體不足提供抗體量,延長(zhǎng)孵育時(shí)間,如4度反應(yīng)過夜。
組織未進(jìn)行抗原修復(fù)有些組織需要經(jīng)過抗原修復(fù)才能檢測(cè)抗原表達(dá)
在固定和包埋過程中,抗原變形導(dǎo)致表位變化

采用多種抗原恢復(fù)方法

包埋是控制溫度在58度或低于58度

沖洗液與反應(yīng)試劑不匹配調(diào)整溶液PH值,注意過氧化物酶底物匹配的溶液中不應(yīng)含有疊氮鈉
2.染色弱抗體濃度過低提高抗體濃度,孵育時(shí)間不能少于60分鐘
抗體孵育時(shí)間過短抗體孵育時(shí)間不能少于60分鐘
標(biāo)本中目的蛋白表達(dá)量低查閱文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫,確定組織中確有目的蛋白強(qiáng)表達(dá)。設(shè)立陽性對(duì)照片,以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果
操作中,切片遺留太多沖洗液,導(dǎo)致試劑稀釋每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液(但防止切片干燥)
孵育時(shí)切片未放平,導(dǎo)致抗體流失孵育時(shí),注意切片應(yīng)水平放置
蛋白封閉過度封閉時(shí)間不要超過10分鐘
不適當(dāng)?shù)臉?biāo)本固定方式選擇合適的固定方法
不適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)方式延長(zhǎng)抗原修復(fù)時(shí)間,或者調(diào)整抗原修復(fù)體系,建議參照生產(chǎn)廠家的說明,同時(shí)結(jié)合標(biāo)本的具體情況來確定
3.非特異性背景染色全片著色抗體濃度過高降低抗體滴度(一般只濃縮性抗體)抗體。
抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程,最好使用定時(shí)器及時(shí)提醒,避免造成時(shí)間延長(zhǎng)。
孵育溫度過高,孵育溫度超過37度建議控