隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對疾病認(rèn)識的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)人類很多疾病的發(fā)病原因與基因突變有著密不可分的關(guān)系。那么如何去治療這些疾病呢？人們自然想到了采用一些技術(shù)手段對突變的基因序列進(jìn)行重新編輯，以期達(dá)到治愈的目的，這項技術(shù)就是基因編輯技術(shù)。基因編輯技術(shù)經(jīng)過了以歸巢酶，ZFN，TALEN等以蛋白質(zhì)與DNA識別與切割為原理的第一代基因編輯技術(shù)的發(fā)展，人們對基因編輯技術(shù)的認(rèn)識不斷加深，但是由于第一代基因編輯技術(shù)操作步驟繁瑣、基因編輯效率低下、基因編輯脫靶現(xiàn)象嚴(yán)重等問題，很難應(yīng)用于生產(chǎn)實踐。2003年，MIT小組首次利用原核生物中CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對真核生物基因完成了編輯，該技術(shù)操作步驟簡單、基因編輯效率高、基因編輯脫靶現(xiàn)象不明顯等，形成了以CRISPR/Cas9為代表，以RNA與DNA的識別與蛋白質(zhì)介導(dǎo)的切割為基本原理的第二代基因編輯技術(shù)。2016年，韓春雨團隊利用原核生物中Argonaute系統(tǒng)，完成對真核生物基因的編輯，該技術(shù)相比于CRISPR/Cas9系統(tǒng)操作更為簡單、基因編輯效率更高、基因編輯脫靶現(xiàn)象更低、對基因在染色體中所在的位置沒有明確要求等，該項技術(shù)極有可能成為以DNA與DNA的識別與蛋白質(zhì)介導(dǎo)的切割為基本原理的第三代基因編輯技術(shù)。下面我們將詳細(xì)介紹CRISPR/Cas9系統(tǒng)和Argonaute系統(tǒng)為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)。

1、CRISPR/Cas9系統(tǒng)為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)

CRISPR/Cas9的結(jié)構(gòu)由Cas9的編碼區(qū)、前導(dǎo)序列和一個由不連續(xù)的重復(fù)序列R與長度相似的間區(qū)序列S間隔排列而成的CRISPR 簇組成，廣泛存在于原核生物。在原核生物中，外源的DNA插入到基因組，一旦插入DNA開始轉(zhuǎn)錄，生物體會將臨近PAM（NGG序列）的序列切割形成短片段，添加到CRISPR 簇中。當(dāng)相同的外源DNA再次插入時，Cas9會特異性的結(jié)合CRISPR 簇中轉(zhuǎn)錄出的RNA短片段(引導(dǎo)RNA)，Cas9與RNA結(jié)合的復(fù)合體會被轉(zhuǎn)運到核內(nèi)，識別PAM完成對全基因組的掃描，一旦出現(xiàn)能與RNA互補的DNA序列，Cas9將對這段DNA進(jìn)行剪切，阻斷外源DNA的入侵?；谶@個原理，只要人為的將CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過腺病毒或慢病毒包裝等，侵入哺乳動物細(xì)胞，根據(jù)插入CRISPR簇中的序列（至少與基因組上19個堿基完全匹配）識別剪切的位點，便完成對真核細(xì)胞基因組的定點剪切。切割完成后，目的位點會出現(xiàn)雙鏈斷裂（DSB），并在一定條件下引起生物體的主動修復(fù)（HDR （同源介導(dǎo)的雙鏈DNA修復(fù)）和NHEJ（非同源性末端結(jié)合））。

基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因敲出實驗流程：1、構(gòu)建含有核定位信號（NLS）的Cas9基因的質(zhì)粒以及能產(chǎn)生誘導(dǎo)RNA（需提前設(shè)計）的質(zhì)粒；2、包裝病毒，滴度檢驗；3、侵染哺乳動物細(xì)胞；4、通過ELISA、WB、熒光實時定量等檢測敲除效果。

2、Argonaute系統(tǒng)為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)

    Argonaute的結(jié)構(gòu)由Argonaute的編碼區(qū)、5'磷酸化雙鏈短DNA（ssDNA）組成，目前僅在部分原核生物中發(fā)現(xiàn)。在真核生物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中基本不存在5'磷酸化的ssDNA，Argonaute通過腺病毒或慢病毒包裝、脂質(zhì)體、電擊等，侵入哺乳動物細(xì)胞，而5'磷酸化的ssDNA主要通過人工合成直接導(dǎo)入細(xì)胞，細(xì)胞表達(dá)Argonaute會特異性的與5'磷酸化的ssDNA結(jié)合，結(jié)合產(chǎn)物會被轉(zhuǎn)運到核內(nèi)，通過ssDNA（最佳為24bp與基因組完全匹配）識別剪切位點，完成對真核細(xì)胞基因組的定點剪切。切割完成后，目的位點會出現(xiàn)雙鏈斷裂，并在一定條件下引起生物體的主動修復(fù)。

    基于Argonaute系統(tǒng)的基因敲出實驗流程：1、構(gòu)建含有核定位信號（NLS）的Argonaute基因的質(zhì)粒以及人工合成ssDNA（需提前設(shè)計）；2、將質(zhì)粒和ssDNA包裹形成脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染染哺乳動物細(xì)胞（也可利用電轉(zhuǎn)）；3、通過ELISA、WB、熒光實時定量等檢測敲除效果。

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