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免疫組織化學(xué)(IHC)常見問題及解答

免疫組織化學(xué)技術(shù)又稱免疫細胞化學(xué)技術(shù),是指用標(biāo)記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng),對相應(yīng)抗原進行定性、定位、定量測定的一項免疫檢測方法。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性和分子生物技術(shù)的敏感性等巧妙結(jié)合,借助顯微鏡的顯像和放大作用,在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等),是單一的靜止的形態(tài)學(xué)描述,上升到結(jié)構(gòu)、功能和代謝為一體的動態(tài)觀察,為疾病的診斷、鑒別診斷和發(fā)病機制的研究提供了強有力的手段。

然而,要想得到一張高質(zhì)量的免疫組化染色切片也并非易事。由于切片制作和免疫組化染色過程均存在很多步驟或環(huán)節(jié),每一個步驟或環(huán)節(jié)都需要操作者嚴格控制實驗條件,否則可能會影響到最終結(jié)果。現(xiàn)就試驗中遇到得常見問題進行分析總結(jié),給進一步給出解決方案,希望能為幫助相關(guān)實驗人員提供實驗成功率。


免疫組織化學(xué)實驗中的常見問題及其解決方法:

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出現(xiàn)的問題可能的原因處理方法
1.染色陰性試劑失效重新試驗,設(shè)立陽性對照
漏加試劑
試劑加入順序顛倒
組織中無目的抗原表達或表達量太低查閱文獻或數(shù)據(jù)庫,確定組織中確有目的蛋白強表達。設(shè)立陽性對照片,以驗證實驗結(jié)果
一抗與二抗種屬不匹配

??仔細確定一抗與二抗種屬無誤,如果一抗來源于兔,則二抗需選擇抗兔二抗,了解一抗的類型,如果一抗是小鼠IgG1,那么二抗應(yīng)選擇抗小鼠IgG1


抗體不足提供抗體量,延長孵育時間,如4度反應(yīng)過夜
組織未進行抗原修復(fù)有些組織需要經(jīng)過抗原修復(fù)才能檢測抗原表達
在固定和包埋過程中,抗原變形導(dǎo)致表位變化

采用多種抗原恢復(fù)方法

包埋時控制溫度在58度或低于58度

沖洗液與反應(yīng)試劑不匹配調(diào)整溶液PH值,注意過氧化物酶底物匹配的溶液中不應(yīng)含有疊氮鈉
2.染色弱
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抗體濃度過低提高抗體濃度,孵育時間不能少于60分鐘
抗體孵育時間過短抗體孵育時間不能少于60分鐘
標(biāo)本中目的蛋白表達量低查閱文獻或數(shù)據(jù)庫,確定組織中確有目的蛋白強表達。設(shè)立陽性對照片,以驗證實驗結(jié)果
操作中,切片遺留太多沖洗液,導(dǎo)致試劑稀釋每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液(但防止切片干燥)
孵育時切片未放平,導(dǎo)致抗體流失孵育時,注意切片應(yīng)水平放置
蛋白封閉過度封閉時間不要超過10分鐘
不適當(dāng)?shù)臉?biāo)本固定方式選擇合適的固定方法
不適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)方式延長抗原修復(fù)時間,或者調(diào)整抗原修復(fù)體系,建議參照生產(chǎn)廠家的說明,同時結(jié)合標(biāo)本的具體情況來確定
3.非特異性背景染色,全片著色
抗體濃度過高降低抗體濃度
抗體孵育時間過長嚴格執(zhí)行操作規(guī)程,最好使用定時器及時提醒,避免造成時間延長
孵育溫度過高,孵育溫度超過37度建議控制孵育溫度