細(xì)胞增殖/抑制實(shí)驗(yàn)方案

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span> 

通過檢測(cè)待測(cè)蛋白對(duì)某種細(xì)胞的有促進(jìn)增殖或抑制增殖的作用來評(píng)價(jià)該蛋白的生物活性。

二、實(shí)驗(yàn)儀器：

倒置顯微鏡 酶標(biāo)儀 超凈工作臺(tái) CO₂培養(yǎng)箱

三、相關(guān)試劑、耗材：

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板  胎牛血清  DMEM/1640培養(yǎng)基  CCK8試劑盒

四、實(shí)驗(yàn)步驟：

1 .將待測(cè)細(xì)胞消化后，用10% DMEM/1640培養(yǎng)基重懸稀釋，按2000-5000 cells/孔接種到96孔板中，每孔100μl。可根據(jù)細(xì)胞自身生長狀態(tài)適當(dāng)調(diào)整接種濃度，抑制實(shí)驗(yàn)可多接種一些。當(dāng)細(xì)胞貼壁后，換無血清的DMEM/1640饑餓過夜。

2. 將孔內(nèi)無血清培養(yǎng)基吸出棄掉，加入用低濃度血清培養(yǎng)基（含1%-5%胎牛血清） 稀釋的待測(cè)蛋白，每孔100μl。待測(cè)蛋白一般按照10倍梯度稀釋，對(duì)照孔加入不含待測(cè)蛋白的培養(yǎng)基。

3. 將加入待測(cè)蛋白后的96孔培養(yǎng)板放入CO₂培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞生長。

五、檢測(cè)方法：

CCK8測(cè)定，使用酶標(biāo)儀在450mM波長處測(cè)定OD值。

注意事項(xiàng)：

1. 細(xì)胞接種密度要適中，在4倍鏡下觀察大概占孔板面積30-40%，不能超過50%，否則細(xì)胞增殖過快不易觀察結(jié)果。密度過低細(xì)胞增殖慢，用CCK8測(cè)定結(jié)果不明顯。不同細(xì)胞增殖速度不同，要根據(jù)細(xì)胞生長特性適當(dāng)調(diào)整細(xì)胞接種密度。

2. 為了降低血清對(duì)細(xì)胞增殖的影響，貼壁細(xì)胞用無血清饑餓過夜后，應(yīng)該用低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，血清濃度不超過5%。

3. 對(duì)于懸浮細(xì)胞無法進(jìn)行無血清饑餓，直接用低濃度血清稀釋到合適的濃度接種到96孔板上。

4. 注意種屬特異性，如有種屬特異性，人源重組蛋白要在相應(yīng)的人源細(xì)胞系上開展蛋白活性實(shí)驗(yàn)，鼠源重組蛋白需要在相應(yīng)鼠源細(xì)胞系上進(jìn)行試驗(yàn)。