一、實驗器材及試劑

1、 實驗器材

• 多樣品研磨珠均質(zhì)儀

• 臺式高速冷凍型微量離心機(jī)

• 熒光定量PCR儀

• 超凈工作臺

• 分光光度計

• 離心管

• TIP頭

2、 主要實驗試劑及耗材

RNA提取液

三氯甲烷

異丙醇

無水乙醇

HyPure TMMolecular Biology Grade Water

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit

FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)

引物

75%乙醇：HyPure ^TMMolecular Biology Grade Water配制

離心管、TIP頭均購濕熱滅菌40min，干燥。

二、熒光定量PCR實驗步驟

1、總RNA抽提（槍頭和離心管均經(jīng)過濕熱滅菌，無RNA酶）

1）取勻漿器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上預(yù)冷。

2）取100mg組織，加入到勻漿器中。

3）充分研磨直至無可見組織塊。

4）12000rpm離心10min取上清。

5）加入250 μl三氯甲烷，顛倒離心管15s，充分混勻，靜置3min。

6）4℃ 下12000rpm離心10min。

7）將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻。

8）-20℃ 放置15min。

9）4℃下12000rpm離心10min，管底的白色沉淀即為RNA。

10）吸除液體，加入75%乙醇1.5ml洗滌沉淀。

11）4℃下12000rpm離心5min。

12）將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺上吹3min。

13）加入15μl無RNA酶的水溶解RNA。

14）55℃ 孵育5min。

15)使用UV1800檢測RNA濃度及純度：儀器空白調(diào)零后取2.5μl 待測RNA溶液于檢測基座上，放下樣品臂，使用電腦上的軟件開始吸光值檢測。

16）將濃度過高的RNA進(jìn)行適當(dāng)比例的稀釋，使其終濃度為200ng/μl.左右。

2、反轉(zhuǎn)錄（槍頭和PCR均經(jīng)過濕熱滅菌，無RNA酶）

1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。

2）加入1μl 逆轉(zhuǎn)錄引物。

3）用無核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至12μl。

4）于PCR儀上65℃ 保溫5min，迅速置冰上冷卻。

5）依次加入4μl  5×buffer，2μl  10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反轉(zhuǎn)錄酶，用槍抽吸混勻。

6）于PCR儀上42℃保溫60min，結(jié)束后80℃保溫5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。

3、定量PCR

1）取0.2ml PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。

2× qPCR Mix12.5μl

7.5μM基因引物2.0μl

反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5μl

ddH₂O8.0μl

2）PCR擴(kuò)增

預(yù)變性95℃，10min

循環(huán)（40次）    95℃，15s→60℃，60s

熔解曲線75℃→95℃，每20s升溫1℃

4、結(jié)果處理

ΔΔCT法：

A=CT(目的基因，待測樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測樣本)

B=CT(目的基因，對照樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因，對照樣本)

K=A-B

表達(dá)倍數(shù)=2^-K