1.固定：去除殘留液體，用1X PBST清洗接種在干凈玻片上的細胞3次，每次3min。在室溫下用新鮮配制的4%多聚甲醛固定15min。

2.1XPBST漂洗三次：去除固定液，1XPBST漂洗3次，每次5min。

3.透化：在1XPBST中加0.1% Triton X-100，孵育20分鐘以提高通透性。

4.1XPBST漂洗三次：去除殘留液體，1XPBST漂洗3次，每次5min。

5.封閉：去除殘留液體，在切片上加5% BSA或血清。確保血清與二抗來源于相同物種。然后在室溫下孵育20min。

6.孵育一抗：去除殘留液體，用適當稀釋比例的一抗覆蓋組織部位，4^oC過夜孵育。

7.復(fù)溫：將切片從4^oC移至室溫靜置約20min，不要立即沖洗切片。

8.1XPBST漂洗三次：去除殘留并浸泡在PBST中，在搖床中以40 RPM漂洗5 min，重復(fù)3次。

9.孵育熒光偶聯(lián)的二抗：去除殘留液體，用適當稀釋比例的二抗覆蓋組織部位，4℃避光孵育60 min。

10.1XPBST漂洗三次：去除殘留并浸泡在PBST中，在搖床中以40 RPM漂洗5 min，重復(fù)3次。

11.滴加50% PBS+50% 甘油于玻片上，立即置于顯微鏡下觀察。