一 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、CO2培養(yǎng)箱、酒精燈、微量移液器、酶標(biāo)儀、CCK-8試劑盒等。

二 實(shí)驗(yàn)步驟

1. 取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞制備成一定濃度的細(xì)胞懸液，每孔100ul加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入2×10³個(gè)/100ul 細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入5×10³個(gè)細(xì)胞/100ul （具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小、細(xì)胞增殖速度的快慢等因素決定)。如果是貼壁細(xì)胞，需要37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)2-4小時(shí)等細(xì)胞貼壁后再開展實(shí)驗(yàn)，如果是懸浮細(xì)胞，不需要預(yù)培養(yǎng)。

2. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，在培養(yǎng)孔中加入0-10ul待測樣本繼續(xù)培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間。如果是做細(xì)胞毒性試驗(yàn)，加入毒性物質(zhì)后的培養(yǎng)時(shí)間需要摸索。要看毒性物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性，一般要根據(jù)細(xì)胞周期來決定，起碼要一代以上的時(shí)間。

3. 將試劑盒中的CCK-8溶液取10ul加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5-4小時(shí)。

4. 測定吸光度。建議采用雙波長進(jìn)行測定，檢測波長430-490nm，參比波長600-650nm，或者采用450nm單波長檢測。

三 注意事項(xiàng)

1. 如果細(xì)胞起始的培養(yǎng)體積為200ul，則需加入20ul的CCK-8溶液，其它情況以此類推。

2. 建議每個(gè)藥物濃度孔設(shè)置3個(gè)復(fù)制孔，最后取均值做曲線。

3. 設(shè)計(jì)好實(shí)驗(yàn)對照，盡量排除其它因素的干擾：

1）空白對照：可以用加了等量細(xì)胞培養(yǎng)液、CCK-8溶液和藥物但沒有加細(xì)胞的孔；

2）陰性對照：不加藥物但加了藥物溶劑的細(xì)胞孔。

4. 本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性，可能會干擾檢測，需設(shè)法去除（加入CCK-8溶液之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物影響。如果藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可）。

5. 加入CCK-8溶液后注意孵育時(shí)間。對于大多數(shù)情況孵育1小時(shí)就可以了。時(shí)間的長短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等實(shí)驗(yàn)情況而定，初次實(shí)驗(yàn)時(shí)可以在0.5、1、2和4小時(shí)后分別用酶標(biāo)儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

6. 當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。

7. 若暫時(shí)不測定OD值，可以向每孔中加入10ul 10% SDS溶液終止反應(yīng)，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測定，吸光度不會變化太大，一般還是建議立刻檢測。

8. 用酶標(biāo)儀檢測前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒有氣泡，否則會干擾測定。