實(shí)驗(yàn)原理

Caspase-3是一種蛋白酶，屬于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族，在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用。caspase-3可以被多種因素活化，在CTL細(xì)胞的殺傷作用中，它既可被Fas/FasL途徑活化，也可以通過顆粒酶B途徑活化。顆粒酶B是CTL細(xì)胞顆粒中的一種絲氨酸酯酶，是哺乳動(dòng)物中除caspase蛋白酶外唯一的在Asp后剪切的蛋白酶，它可以特異性剪切ICE家族蛋白酶催化亞單位C端的XXD序列，并活化caspase 2、3、6、7、8、9、10。Caspase-3能催化特異性底物acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide (Ac-DEVD-pNA)水解生成對(duì)硝基苯胺,通過在405nm對(duì)硝基苯胺發(fā)色強(qiáng)度的檢測(cè)來計(jì)算出caspase-3的活性大小。

試劑 

2x反應(yīng)buffer: 50mmol/L HEPES，pH7.4

100mmol/L NaCl

10mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)

2mmol/L EDTA

10% 甘油

儀器

96孔酶標(biāo)板及酶標(biāo)儀

實(shí)驗(yàn)步驟

1底物溶解及稀釋：Ac-DEVD-pNA用DMSO溶解配成儲(chǔ)存液，臨用時(shí)用1X反應(yīng)buffer稀釋成4mmol/L工作液，注意避光。

2對(duì)硝基苯胺儲(chǔ)存液：將對(duì)硝基苯胺用無水乙醇溶解后，用1X反應(yīng)buffer稀釋配制成儲(chǔ)存液。

3將重組人的Caspase-3用1X反應(yīng)buffer稀釋后，取50μl加入含有50μl的2x反應(yīng)buffer的酶標(biāo)板中，最后再加入5μl底物工作液，37℃水浴，避光反應(yīng)2h。在405nm下讀取OD值。將200μM對(duì)硝基苯胺儲(chǔ)存液，用1X反應(yīng)buffer進(jìn)行2倍梯度稀釋，在405nm下讀取OD值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 結(jié)果計(jì)算

酶活定義：caspase-3在1min內(nèi)水解產(chǎn)生1pmol對(duì)硝基苯胺為一個(gè)活性單位U。

比酶活：1μg caspase-3蛋白在1min內(nèi)水解產(chǎn)生1pmol對(duì)硝基苯胺，U/μg

將酶標(biāo)儀測(cè)定OD值帶入對(duì)硝基苯胺繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得出的最終酶活

比酶活=pmol/min/μg

重組人caspase-3最終活性為2196pmol/min/ug。