病毒的“擬”生長
“病毒”二字依據拆文解字意為引起疾病的毒素，與現代醫(yī)學對其定義不謀而合。病毒是一類獨特的傳染因子，它能夠利用宿主細胞的營養(yǎng)物質來自主地復制自身的DNA或RNA、蛋白質等生命組成物質的微小生命體。病毒的顯著特點是結構簡單，微小到甚至無法用普通顯微鏡觀察，而且無法脫離活體進行獨立的代謝活動和復制。
如此常見卻又特別的病毒，要如何開展相應的科學研究呢？
從病毒特點中不難發(fā)現，它賴以生存的關鍵點就是活體細胞。隨著對各類病毒的研究深入，迫切需要通過易感細胞建立體外感染模型。也就是本文題目中的提到的模擬病毒生存發(fā)展的“擬”生長。
我們以引發(fā)全球性公共衛(wèi)生問題的乙肝病毒（Hepatitis B virus, HBV）作為研究對象進行體外感染的模擬實驗的小科普。HBV是嗜肝病毒（如圖1）,肝臟是其主要的侵犯和復制場所,因此肝源細胞就成病毒DNA轉染的首選靶細胞，研究者們選用的是經過轉化后連續(xù)傳代培養(yǎng)的分化的肝癌細胞,如HepG2細胞系[1]。
圖1 乙肝病毒為嗜肝病毒（圖片來源于網絡）
病毒體外感染形式分為兩種：一種是用病毒直接感染細胞(如骨髓中的淋巴細胞、人胎盤滋養(yǎng)層細胞系Bewo細胞等[2]，觀察病毒的形態(tài)，確定細胞是否可被病毒體外感染以及研究病毒與細胞的相互作用為后續(xù)建立病毒檢測、預防感染與治療提供依據。
另外一種為了更深層次研究病毒基因組的功能，闡述乙肝病毒嵌入人類基因組的機制和病毒致癌的部分機制。通過構建乙肝病毒基因重組腺病毒載體，將攜帶HBV基因的重組腺病毒感染HEK293細胞進行包裝、擴增、分離純化,將擴增得到的HBV感染HepG2細胞[3]。鑒于病毒體外感染細胞模型的建立有助于對病毒顆粒形態(tài)、致病機理、復制與表達等基礎性研究，而基礎性研究的進展也促進體外細胞感染模型的建立[4-5]。
在細胞模型已取得成功的基礎上，更多的研究人員已將目光鎖定在動物模型上。廈門大學夏寧邵教授團隊和浙江大學附屬第一醫(yī)院李君教授團隊歷經5年的協(xié)同攻關，建立了國際上第一個高度模擬人類乙肝病毒（HBV）自然感染誘發(fā)的慢乙肝肝硬化小鼠模型。這是國內外首次利用單種的人BMSC移植實現了人同源肝細胞與多種免疫細胞在小鼠體內的雙重嵌合，成功模擬了人類HBV自然感染和乙肝肝硬化發(fā)病過程，解決了HBV感染與發(fā)病機制研究和抗乙肝肝硬化新藥研發(fā)缺少高質量動物模型的國際難題。
圖2 人類乙肝病毒（HBV）自然感染誘發(fā)的慢乙肝肝硬化小鼠模型
云克隆一直致力于服務全球科研人員，提供優(yōu)質的檢測產品以及實驗服務。我們深知細胞感染模型的重要性，我司目前可以提供成熟的腺病毒，慢病毒包裝實驗服務，也可制作千余種動物模型，涉及各種人類疾病動物模型、轉基因動物模型和基因敲除動物模型。旨在為您的實驗保駕護航。
[服務項目內容]
????一、病毒包裝實驗服務
項目內容 | 實驗流程 | 周期 |
實驗方案確定 | ??1. 客戶信息分析?? ??2. 實驗方案確定?? | ?1周 |
目的基因獲取 | 1. PCR獲取目的基因片段?? ??2. 基因化學合成?? | ??2-4周 |
??載體構建 | 1. 載體構建?? ??2. 質粒提取和去內毒素處理?? | ??2-3周 |
共轉??? | ??1. 表達質粒和輔助質粒共同轉染293(腺病毒）/293T細胞??（慢病毒） ??2. 細胞培養(yǎng)?? | ??1周 |
重組病毒收集 | ??1. 重組病毒收集、濃縮、分裝和保存?? ??2. 重組病毒滴度檢測?? | ??1周 |
二、腫瘤移植(TT)小鼠模型（示例）
目前在肝癌研究中多采用異體移植法將腫瘤細胞株注射到動物皮下形成局部瘤塊來構建移植瘤模型，相比機體原發(fā)性肝癌的形成及病理生理學變化仍有一定不同。通過向裸鼠肝臟注射肝癌細胞建立肝臟原位腫瘤模型，觀察其原位瘤成瘤的過程及狀態(tài)，能較好的模擬人體肝癌生長過程，為進一步抗肝癌免疫研究提供實驗動物模型。
1. 細胞株： 熒光素酶基因標記的人肝癌細胞株HepG2-luc。
2. 裸鼠肝臟原位成瘤模型的建立：
2.1 將標準條件下培養(yǎng)的處于對數生長期的HepG2-luc 細胞消化、離心，將所得的約 5×10 6 個細胞溶于 0.1 mL DMEM 培養(yǎng)液待用。
2.2 使用3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，待麻醉生效后，開腹暴露肝臟，用1ml胰島素注射針取準備好的細胞注射于裸鼠肝臟內，用5-0絲線縫合傷口，活力碘消毒傷口，將裸鼠放在加熱墊上，待清醒后正常飲食飼養(yǎng)。
3. 熒光活體成像檢測：在成瘤后對裸鼠進行生物發(fā)光活體成像檢測，成像前使用3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，再通過腹腔注射3mg底物 luciferin，底物注射后20~30分鐘后進行生物發(fā)光活體成像檢測。
圖3 生物發(fā)光活體成像檢測結果
更多產品及服務信息，歡迎您關注我們！
參考文獻：
[1] Abraham T M , Lewellyn EB, Haines K M,et al.Characterization Of the contribution of spliced RNAs of hepatitis B virus to DNA synthesis intransfected cultures of Huh7 and HepG2 cells[J].Virology,2008,379:30-7.
[2] 劉明慧. 乙型肝炎病毒感染Bewo細胞模型的建立[J]. 中國婦幼保健, v.26(31):4901-4903.
[3] Benjamin Y. Winer et al, Analysis of host responses to hepatitis B and delta viral infections in a micro-scalable hepatic co-culture system, Hepatology (2019). DOI: 10.1002/hep.30815.
[4] 刁志宏,張明霞,朱幼芙,等.重組乙型肝炎病毒P22e基因在HepG2細胞中的表達[J].第四軍醫(yī)大學學報,2006,27(11):1008-10.
[5] 王安輝 徐德忠 門可 閆水平 張景霞 盧娟.乙型肝炎病毒體外感染HepG2細胞的初步研究[J].世界感染雜志,2005,(06):536-536頁.