在Western Blot（WB）的實驗過程中，總會遇到各種各樣的問題：沒有條帶，雜帶多，轉膜不成功，曝光時間把握不好……不要著急，根據(jù)多年的WB經驗，我們總結了以下WB實驗過程中出現(xiàn)各種突發(fā)狀況的分析和處理方法：

1. SDS-PAGE出現(xiàn)異常條帶

1）微笑現(xiàn)象

處理方法：可能是由于凝膠的中間部分凝固不均導致，待其充分凝固后再做實驗。

2）拖尾現(xiàn)象

處理方法：可能是由于樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起。建議：加樣前離心；加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。

3）條帶粗

處理方法：可能是由于濃縮膠未濃縮好。建議：增加濃縮膠長度；保證濃縮膠的pH正確（6.7）；降低電壓。

4）紋理現(xiàn)象

處理方法：可能是由于樣本中不溶性顆粒引起的。建議：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。

2. 轉膜條件及膜的選擇

下圖為不同轉膜方法的轉膜效率：

可以觀察到轉膜效率：濕轉過夜>濕轉3小時>半干轉1小時。

在轉膜過程中，靶蛋白分子量小轉印時間縮短，分子量大則適當延長轉膜時間。并建議優(yōu)先選擇聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜，相對硝酸纖維素（NC）膜機械強度高，和蛋白結合牢。

3. 條帶出現(xiàn)降解或斷裂帶

lane 13：心臟組織震動溶解2h；lane 14：心臟組織短時超聲；lane 15：心臟組織超聲10min

處理方法：樣本制備過程中盡量保持低溫，避免蛋白變性、降解、斷裂，對于胃腸胰等蛋白酶含量高的樣本建議添加蛋白酶抑制劑，蛋白酶抑制劑建議新鮮配制。

4. 曝光時間過長或過短出現(xiàn)非特異性帶或條帶消失

處理方法：建議選不同時間點多曝光幾次。

5. 條帶不整齊

處理方法：可能是由于膠凝固不均勻，建議待膠完全凝固后上樣；可能是由于電泳的時候，有氣泡在膠的下邊緣，建議電泳前，檢查并趕走膠底部的氣泡；可能是由于上樣buffer不是工作液濃度，建議重新配置上樣buffer；可能是由于拔梳子導致樣品孔不齊，建議水平緩慢的拔梳子。

6. 無條帶

處理方法：可能是轉膜失敗，可以通過立春紅染色檢驗；可能是一抗二抗用錯或濃度不合適，可設置陽性對照或重新調整抗體濃度；ECL發(fā)光底物失效，可換用新的發(fā)光底物。

WB的實驗流程相對較長，每個步驟都會對最后的實驗結果造成影響。我們在實驗過程中，應做好實驗對照、實驗記錄，步步監(jiān)測，方便查找原因。