蛋白酶體相關(guān)自身炎癥綜合征 (PRAAS) 是一種單基因疾病，患者表現(xiàn)為患有嚴(yán)重的炎癥性疾病，包括關(guān)節(jié)攣縮、肌肉萎縮、小細(xì)胞性貧血、慢性非典型中性粒細(xì)胞性皮膚病伴脂肪營養(yǎng)不良和溫度升高。與目前已知的由白細(xì)胞介素IL-1介導(dǎo)的自身炎癥性疾病相比，PRAAS的基因突變會(huì)導(dǎo)致蛋白酶體功能障礙、Ⅰ型干擾素(IFN)持續(xù)產(chǎn)生，且對(duì)IL-1抑制劑的治療無反應(yīng)。2022年2月，Science子刊Science Immunology雜志上發(fā)表了一篇題為“Protein kinase R is an innate immune sensor of proteotoxic stress via accumulation of cytoplasmic IL-24”的文章，該文章揭示了蛋白激酶R是一種先天免疫傳感器，通過細(xì)胞質(zhì)中IL-24的積累來介導(dǎo)蛋白毒性應(yīng)激。

       研究者利用CRISPR-Cas9介導(dǎo)THP-1細(xì)胞免疫蛋白酶體亞基iβ5和iβ1的基因缺失，在體外建立了PRAAS細(xì)胞模型。然后，研究者使用ELISA檢測(cè)多個(gè)細(xì)胞株的CXCL10和IFN-β含量，發(fā)現(xiàn)這些PRAAS模型細(xì)胞株表現(xiàn)出與PRAAS患者類似的炎癥反應(yīng)，其轉(zhuǎn)錄和IFN-β分泌增加。通過流式細(xì)胞術(shù)觀察到在單細(xì)胞水平上IFN-β蛋白水平升高。通過qPCR檢測(cè)，使用廣譜去泛素化酶(DUB)抑制劑PR619后，炎癥基因的表達(dá)與細(xì)胞系的炎癥表型相一致。這是由于靶向蛋白酶體降解的泛素化物質(zhì)的積累，廣譜去泛素酶 (DUB) 抑制劑 PR619 增加了這種蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激和由此產(chǎn)生的炎癥基因表達(dá)。(見圖1)

圖1 CRISPR-Cas9 介導(dǎo)的 iβ5 或 iβ1 缺失的細(xì)胞系

（圖片來源于《Science Immunology》雜志）

      蛋白激酶R(PKR) 通過腫瘤壞死因子 (TNF) 受體相關(guān)因子 3 (TRAF3) 和TRAF2 和 TRAF5 的直接相互作用激活 NF-κβ 來驅(qū)動(dòng) IFN-αβ 的誘導(dǎo)。研究者發(fā)現(xiàn)用cGAMP刺激STING信號(hào)通路可誘導(dǎo)IFNB1的轉(zhuǎn)錄，使IFNB1的轉(zhuǎn)錄水平在親本THP-1細(xì)胞和PKR缺失的THP-1細(xì)胞中相似，說明由于 PKR 缺陷導(dǎo)致 IFNB1 基因誘導(dǎo)缺失對(duì)蛋白酶體抑制具有特異性。通過免疫印跡觀察到PRAAS細(xì)胞系中PKR基因缺失導(dǎo)致STAT1磷酸化缺失，炎癥基因表達(dá)減弱。使用特異性抑制劑 C16 對(duì) PKR 進(jìn)行化學(xué)抑制，發(fā)現(xiàn) iβ5-/- 細(xì)胞中炎癥基因的表達(dá)得到抑制。此外，研究者還研究了PKR缺陷小鼠(PKR?/?)和它們的同窩對(duì)照小鼠(PKR+/+)，發(fā)現(xiàn)硼替佐米可誘導(dǎo)PKR+/+血液和脾臟中Ifnb1, Ifna4, Il6, 和Usp18 mRNA的表達(dá)上調(diào)；然而，PKR?/?缺失減弱了血液和脾臟中的炎癥基因轉(zhuǎn)錄。這些數(shù)據(jù)表明，PKR 在體外和體內(nèi)都是蛋白酶體抑制下游炎癥的先天免疫傳感器。（見圖2）

圖2 炎癥基因表達(dá)對(duì)PKR 具有依賴性

（圖片來源于《Science Immunology》雜志）

       研究者利用CRISPR-Cas9基因編輯產(chǎn)生IL-24缺失的細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)IL-24是蛋白酶體抑制劑地蘭佐米誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的唯一候選藥物。通過qPCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)poly(dA:dT)刺激cGAS信號(hào)通路誘導(dǎo)IFNB1轉(zhuǎn)錄的程度與親本THP-1細(xì)胞中觀察到的相同。從免疫印跡的結(jié)果來看，在IL-24缺失的iβ5?/?和iβ1?/?細(xì)胞株中PKR的激活減少。研究者給對(duì)照組小鼠或IL-24?/?小鼠注射硼替佐米，在對(duì)照組小鼠中，eIF2α和STAT1的磷酸化發(fā)生在PKR的下游，但在IL-24?/?小鼠中不存在。這些數(shù)據(jù)表明，在體內(nèi)和體外IL-24驅(qū)動(dòng)PKR依賴的炎癥反應(yīng)。為了確定蛋白酶體功能障礙條件下PKR和IL-24是否相互作用，研究者在iβ5?/?THP-1細(xì)胞和對(duì)照組中進(jìn)行了PKR的免疫沉淀，發(fā)現(xiàn)IL-24與PKR聯(lián)合免疫沉淀只發(fā)生在蛋白酶體被破壞時(shí)。在IL-24-Halo低、穩(wěn)定表達(dá)的U2OS細(xì)胞中，研究者發(fā)現(xiàn)在蛋白酶體受到抑制的情況下，IL-24在細(xì)胞質(zhì)中積累。（見圖3）

圖3 IL-24在蛋白酶體抑制的條件下激活PKR

（圖片來源于《Science Immunology》雜志）

       研究者觀察到蛋白酶體亞單位突變患者的成纖維細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的IL-24、磷酸化的PKR和eIF2水平增加。用 PKR 抑制劑 C16 治療 PRAAS PBMC可消除 PBMC患者中的 PKR 磷酸化，從而導(dǎo)致患者細(xì)胞中 STAT1 和 eIF2α的活化減少，顯著降低了PRAAS患者外周血單核細(xì)胞中IFN-αβ和ISG基因的表達(dá)。在嬰兒期發(fā)作的 STING 相關(guān)血管病 (SAVI)患者的 PBMC 樣本中，PKR 抑制不會(huì)改變 IFN-αβ亞型或 ISG 基因表達(dá)，說明這個(gè)途徑在PRAAS中是特有的。在PRAAS患者來源的細(xì)胞中IFN-αβ亞型轉(zhuǎn)錄升高，使用C16可使其正?；?。（見圖4）

圖4 PKR在PRAAS患者樣本中介導(dǎo)炎癥信號(hào)傳導(dǎo)

（圖片來源于《Science Immunology》雜志）

       總的來說，這些發(fā)現(xiàn)不僅對(duì) PRAAS 具有重要意義，而且對(duì)與蛋白毒性應(yīng)激和炎癥相關(guān)的其他疾病（例如神經(jīng)退行性疾病）也具有重要意義。為開發(fā)PKR抑制藥物，靶向治療蛋白酶體功能障礙提供了參考。

       云克隆開發(fā)了上述研究中涉及的相關(guān)指標(biāo)的蛋白、抗體、ELISA試劑盒等產(chǎn)品以助力腫瘤治療相關(guān)研究，部分指標(biāo)節(jié)選如下，供參考。