云克隆基于國際最新流式熒光發(fā)光法（Flow Luminescence Immunoassay，F(xiàn)LIA）開發(fā)推出了Multiplex Assay Kit。FLIA技術(shù)使用流式細胞術(shù)分析不同熒光標記的微球，同時對多種不同的生物學(xué)指標進行檢測。

Multiplex Assay Kit試劑盒的數(shù)據(jù)如何完成標曲擬合及樣本計算呢？能否用EXCEL軟件完成呢？接下來我們以 Cloud-Clone  Corp.的 LMA079Hu  人白介素6(IL6)等多因子檢測試劑盒（流式熒光發(fā)光法）及LMA461Ge  雌二醇(E2)等多因子檢測試劑盒（流式熒光發(fā)光法）實驗結(jié)果為例，展開詳細介紹。

 LMA079Hu  利用雙抗夾心法定量測定樣本中IL6含量。如圖1所示，最高濃度的標準品（500pg/mL）經(jīng)4倍倍比稀釋至0.49pg/mL，空白孔為標準品稀釋液（0濃度孔）。

圖1. 標準曲線數(shù)據(jù)

 首先將標準品各孔的MFI值減去空白MFI值（本底），得到校正MFI值，以標準品各孔的校正MFI值取Log10后的值為X軸（標黃色），標準品相應(yīng)濃度取Log10后的值(標紅色)為Y軸，作XY散點圖，得到一條6點曲線，其中X軸為校正MFI的對數(shù)值（Log of MFI），Y軸為濃度的對數(shù)值（Log of Conc.），如圖2所示。

圖2. 標準曲線示例圖

接下來我們看看如何做出圖2中的標準曲線，選中Log of MFI及Log of Conc.各數(shù)據(jù)（標黃色及紅色區(qū)域），左鍵點擊插入，再左鍵點擊XY散點圖（見圖3A）。圖表上便會彈出散點圖（見圖3B），鼠標左鍵點擊曲線中的任何一點，圖中6點都會被選中，點擊鼠標右鍵，在菜單欄中選擇“添加趨勢線”。在頁面右邊出現(xiàn)的菜單欄里左鍵點擊“趨勢線”，選擇“多項式(P)”并將“順序”設(shè)定為2。最后，勾選“顯示公式(E)”和“顯示R平方值(R)”（如圖3C），便會出現(xiàn)標準曲線的對應(yīng)公式及R2 值（如圖2所示）。

圖3A. 標曲擬合過程示意圖A

圖3B. 標曲擬合過程示意圖B

圖3C. 標曲擬合過程示意圖C

圖3.  標曲擬合過程示意圖

得到公式后，將樣本MFI值扣除空白MFI值，得到樣本校正MFI值，將校正MFI值取對數(shù)后作為X帶入公式，算得Y值后，做以10為底的指數(shù)運算，若樣本原液檢測，計算的Y值為樣本中靶因子的濃度，若樣本稀釋后檢測，計算的Y值乘以稀釋倍數(shù)，為樣本中靶因子的濃度。    

對于一些化學(xué)小分子及多肽類物質(zhì)，常采用競爭法測定，競爭法標曲擬合與雙抗夾心法有所不同，詳細標曲擬合和樣本計算方法如下：

LMA461Ge利用競爭法定量測定樣本中E2含量。如圖4所示，最高濃度的標準品（1000pg/mL）經(jīng)4倍倍比稀釋至0.98pg/mL，空白孔為標準品稀釋液（0濃度孔）。

圖4. 標準曲線數(shù)據(jù)

將標準品各孔的MFI值取Log10后的值為X軸（標黃色），標準品相應(yīng)濃度取Log10后的值(標紅色)為Y軸作XY散點圖，得到一條6點曲線，其中X軸為MFI的對數(shù)值（Log of MFI），Y軸為濃度的對數(shù)值（Log of Conc.），如圖5所示。

圖5. 標準曲線示例圖 

接著，選中Log of MFI及Log of Conc.各數(shù)據(jù)（標黃色及紅色區(qū)域），左鍵點擊插入，再左鍵點擊XY散點圖（見圖6A）。圖表上便會彈出散點圖（見圖6B），鼠標左鍵點擊曲線中的任何一點，圖中6點都會被選中，點擊鼠標右鍵，在菜單欄中選擇“添加趨勢線”。在頁面右邊出現(xiàn)的菜單欄里左鍵點擊“趨勢線”，選擇“多項式(P)”并將“順序”設(shè)定為2。最后，勾選“顯示公式(E)”和“顯示R平方值(R)”（如圖6C），便會出現(xiàn)標準曲線的對應(yīng)公式及R2 值（如圖5所示）。

圖6A. 標曲擬合過程示意圖A

圖6B. 標曲擬合過程示意圖B

圖6C. 標曲擬合過程示意圖C

圖6. 標曲擬合過程示意圖

得到公式后，將樣本MFI值取對數(shù)后，作為X帶入公式，算得Y值后，做以10為底的指數(shù)運算，若樣本原液檢測，計算的Y值為樣本中靶因子的濃度，若樣本稀釋后檢測，計算的Y值乘以稀釋倍數(shù)，為樣本中靶因子的濃度。

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