熒光素酶（luciferase）在一定條件下可以催化熒光素（luciferin），產(chǎn)生自發(fā)光現(xiàn)象（如圖1）。熒光素或熒光素酶不是特定的分子，而是對于所有能夠產(chǎn)生熒光的底物和其對應(yīng)的酶的統(tǒng)稱。目前比較常見的有螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶，海螢熒光素酶等。螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶組成的雙報(bào)告系統(tǒng)在基因的表達(dá)調(diào)控、信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用、高通量藥物篩選、siRNA和miRNA篩選等多個研究領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

                           圖1. 熒光素酶與熒光素的發(fā)光反應(yīng)

螢火蟲熒光素酶是目前研究中使用最為廣泛的熒光素酶。它由550個氨基酸組成，翻譯后的蛋白質(zhì)不需要修飾即可獲得酶活性。高濃度酶的累積幾乎沒有細(xì)胞毒性，可用于原核和真核細(xì)胞。反應(yīng)產(chǎn)生熒光的組織穿透能力明顯強(qiáng)于綠色熒光蛋白（GFP）。該反應(yīng)是酶與底物相互反應(yīng)發(fā)光，具有高特異性；熒光產(chǎn)生的過程不需要激發(fā)光的存在，幾乎沒有背景信號，信噪比高。

熒光素酶基因通過基因工程的手段整合到預(yù)期觀察的細(xì)胞染色體DNA上，可表達(dá)具有生物活性的熒光素酶，經(jīng)過一系列篩選和鑒定就能得到穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株。當(dāng)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時, 熒光素酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。當(dāng)外源給予其底物熒光素，在ATP和O₂存在的條件下，可在活細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且發(fā)光光強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。下面以HepG2細(xì)胞為例，介紹HepG2-luc穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建的流程。

1 熒光蛋白載體的構(gòu)建

螢火蟲熒光素酶基因通過分子克隆的方式構(gòu)建到質(zhì)粒上。

2. 慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

? 取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，胰酶消化調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁵/ml，種于6孔板內(nèi)，每孔2ml，將6孔板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到30 %~40 %時，即可進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染。

? 按照MOI=10計(jì)算病毒使用量，然后加入相應(yīng)量的病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔添加2ug/ml Polybrene作為助轉(zhuǎn)劑，將6孔板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

? 感染8-12小時后，更換為新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72小時。

3. Puromycin抗性篩選

? 取上述轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，先用新鮮培養(yǎng)基傳代1次，穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)后，可添加含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

? 待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%-80%時，吸棄原培養(yǎng)基，加入含1ug/ml的嘌呤霉素新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

? 用1ug/ml的嘌呤霉素維持培養(yǎng)3天后，更換為2ug/ml的嘌呤霉素新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；3天后再更換為5ug/ml的嘌呤霉素新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；3天后再更換為10ug/ml的嘌呤霉素新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；直至沒有病毒感染的對照組細(xì)胞全部被Puromycin殺死。

4. 細(xì)胞體外生物發(fā)光檢測

? 用蒸餾水溶解D-熒光素鈉鹽，配制成30mg/ml的儲存液（200×）?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b于-20℃或-80℃凍存，避免反復(fù)凍融。

?  用預(yù)熱好的組織培養(yǎng)基1:200稀釋儲存液，配制工作液（終濃度150μg/ml）

? 去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。

? 待圖像分析前，向細(xì)胞內(nèi)添加1×熒光素工作液，然后進(jìn)行圖像分析

? 細(xì)胞成像結(jié)果展示如下：

圖2 HepG2-luc穩(wěn)定細(xì)胞系發(fā)光檢測

2.  細(xì)胞體內(nèi)活體成像檢測：

? 裸鼠成瘤：取生長良好的細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后取100μl（含5*106個細(xì)胞）的細(xì)胞懸液經(jīng)皮下接種于小鼠，每天正常飲食。

? 動物成瘤后即可進(jìn)行活體成像

? 1）用無菌的PBS（w/o Mg2+）或者DPBS（w/o Mg2+）配制D-熒光素鈉鹽工作液（15mg/ml），0.2μm濾膜過濾除菌?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b于-20℃或-80℃凍存，避免反復(fù)凍融。一旦使用，放到4℃解凍，保持冰冷且避光。

? 2） 注射量取決于注射方式，具體如下：

3） 成瘤的動物 采用腹腔注射即可，注射入體內(nèi)10-20 min（待光信號達(dá)到最強(qiáng)穩(wěn)定平臺期），再進(jìn)行成像分析（如圖3）。

                               圖3 成瘤小鼠活體成像檢測

云克隆還為客戶提供過多種luc穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

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