親環(huán)蛋白A（cyclophilin A，CypA）是人類細(xì)胞中首個發(fā)現(xiàn)具有肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶活性的折疊酶，具有強大的促炎作用，但是有研究者發(fā)現(xiàn)它還能抑制炎癥反應(yīng)。2022年5月，《Cell》雜志上發(fā)表了一篇題為“Delicate regulation of IL-1β-mediated inflflammation by cyclophilin A”的文章，在這項研究中，研究者發(fā)現(xiàn)CypA通過增加白介素1β（IL-1β）的產(chǎn)生促進(jìn)炎癥激活，在炎癥消退期促進(jìn)冗余的pro IL-1β降解和emt介導(dǎo)的肺修復(fù)，表明炎癥反應(yīng)的調(diào)控復(fù)雜而微妙。

       研究者用野生型（WT）和CypA敲除型（Ppia-/-）小鼠建立了脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的肺部炎癥模型。采用蘇木精和伊紅染色以及病理評分來評估肺部炎癥的嚴(yán)重程度。發(fā)現(xiàn)CypA最初促進(jìn)（治療后6小時至3天），然后抑制（5至7天）脂多糖誘導(dǎo)的病理性肺損傷。qPCR、ELISA和免疫組化分析的結(jié)果也證明這一趨勢?；貧w分析結(jié)果顯示IL-1β在肺泡灌洗液（BALF）(R²=0.8411)和血清(R²=0.9533)中的表達(dá)量與病理評分呈線性關(guān)系。（見圖1）

圖1 CypA通過IL-1β的表達(dá)調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)的肺部炎癥。

（圖片來源于《Cell》雜志）

       研究者通過ELISA檢測ATP刺激炎癥小體，在WT的上清液比Ppia-/-的上清液中觀察到更多成熟的IL-1β。在免疫印跡實驗中，觀察到CypA促進(jìn)了骨髓源巨噬細(xì)胞（BMDM）細(xì)胞中內(nèi)源性pro-IL-1β的降解。MG132抑制了pro-IL-1β的降解，說明pro-IL-1β是通過泛素-蛋白酶體途徑降解的。接著，研究者采用質(zhì)譜法鑒定出pro-IL-1β的三個潛在泛素化位點(K73、K132和K143)，K73R、K132R和K143R突變會導(dǎo)致K48-linked pro-IL-1β泛素化水平降低，而K132R和K143R突變會導(dǎo)致K63-linked pro-IL-1β泛素化水平降低。將NLRP3、ASC和caspase-1共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，用ATP刺激60min，研究者發(fā)現(xiàn)K143R突變時，IL-1β表達(dá)量顯著降低，說明K143R阻止了pro IL-1b分裂成活性的IL-1b，表明K143是pro-IL-1β加工的關(guān)鍵位點。（見圖2）

圖2 CypA通過調(diào)節(jié)K48-linked和K63-linked泛素化來促進(jìn)前IL-1β的加工和降解。

（圖片來源于《Cell》雜志）

       通過免疫共沉淀法檢測E3連接酶與pro-IL-1β或CypA的相互作用，結(jié)果顯示，E3連接酶AIP4、RNF5、RNF125和Smurf1與pro-IL-1β相互作用，Smurf1和AIP4與CypA相互作用。然后，研究者通過實驗發(fā)現(xiàn)只有Smurf會促進(jìn)pro-IL-1β的裂解，并促進(jìn)CypA調(diào)節(jié)的pro-IL-1β降解。泛素化分析顯示，CypA促進(jìn)了Smurf1介導(dǎo)的pro-IL-1β的K48-linked和K63-linked泛素化。此外，CypA能夠增加293T細(xì)胞和BMDMs中Smurf1和pro-IL-1β之間的相互作用，這表明CypA通過增強Smurf1與pro-IL-1β的結(jié)合促進(jìn)了pro-IL-1β的K48-linked和K63-linked泛素化。（見圖3）

圖3 Smurf1參與了Cypa調(diào)控的K48-linked和K63-linked pro IL-1β泛素化。

（圖片來源于《Cell》雜志）

圖4 CypA加重了IL-1β觸發(fā)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生和肺損傷。

（圖片來源于《Cell》雜志）

       研究者接著研究了CypA在IL-1β觸發(fā)的II型EMT中的作用。肺切片染色結(jié)果顯示，在IL-1β處理后7天，WT小鼠的肺纖維化程度和評分明顯高于Ppia-/-小鼠。檢測了CypA對IL-1β刺激的人II型肺泡上皮細(xì)胞系（A549）細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)CypA促進(jìn)了細(xì)胞遷移和侵襲。接下來研究CypA是否對EMT的關(guān)鍵分子特征有影響。WT和Ppia-/-小鼠肺組織免疫熒光組化檢測顯示，CypA顯著增加β-catenin和α-SMA表達(dá)，但降低E-cadherin表達(dá)，WB在A549細(xì)胞中證實。提示CypA可促進(jìn)II型肺EMT，促進(jìn)肺修復(fù)。（見圖5）

圖5 CypA促進(jìn)IL-1β觸發(fā)的EMT進(jìn)行肺修復(fù)。

（圖片來源于《Cell》雜志）

        對IL-1β處理的A549/WT和A549/CypA細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組綜合分析。與A549/CypA細(xì)胞相比，A549/WT細(xì)胞中E-cadherin下調(diào)，Zeb1、N-cadherin和β-catenin上調(diào)。差異基因和蛋白質(zhì)的功能分析顯示，ILK和AKT可能通過ILK/AKT信號通路與Cypa調(diào)控的EMT相關(guān)。用IL-1β對A549和A549/CypA細(xì)胞進(jìn)行不同時間的刺激，以檢測CypA對ILK/AKT信號通路的影響。WB結(jié)果顯示，CypA對磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、ILK和AKT的磷酸化水平均有顯著的提高，提示CypA參與了ILK/AKT信號通路的上調(diào)。此外，觀察到CypA能夠與ILK相互作用，并進(jìn)一步增強293T細(xì)胞和A549細(xì)胞中ILK與AKT之間的相互作用。這些數(shù)據(jù)表明，CypA通過靶向ILK促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的EMT。（見圖6）

圖6 CypA通過ILK/AKT途徑促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的EMT。

（圖片來源于《Cell》雜志）

       泛素化分析顯示，CypA促進(jìn)了K63-linked ILK泛素化，而不是K48-linked ILK泛素化，去泛素化酶Cyld參與了CypA對K63-linked ILK泛素化的調(diào)控。此外，研究者發(fā)現(xiàn)CypA可以抑制A549細(xì)胞中Cyld和ILK的相互作用。共免疫沉淀實驗表明，CypA過表達(dá)時Cyld-ILK相互作用減弱，表明CypA和Cyld相互競爭ILK相互作用。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)了5個ILK泛素化位點(K141、K154、K165、K209和K435)。在這些位點中，只有K141或K154突變導(dǎo)致了ILK的K63-linked泛素化降低和ILK-AKT相互作用中斷。CypA抑制Cyld介導(dǎo)的K141和K154位點 K63-linked ILK 的去泛素化，然后增加ILK-AKT的相互作用，從而上調(diào)ILK/AKT通路，促進(jìn)IL-1β觸發(fā)的EMT。（見圖7）

圖7 CypA抑制Cyld介導(dǎo)的，K63連接的ILK去泛素化。

（圖片來源于《Cell》雜志）

       總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明，CypA不僅促進(jìn)炎癥激活，還能促進(jìn)炎癥消退。因此，在炎癥激活階段阻斷CypA是一種潛在的抗炎策略。同時，在考慮使用CypA阻斷治療炎癥時，也不能采取“一刀切”的阻斷CypA。

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