前面小云有介紹衰老與睡眠障礙之間的關(guān)系，由此可以看出睡眠對于人體健康起著至關(guān)重要的作用。據(jù)調(diào)查，我國有超3億人存在睡眠障礙，失眠發(fā)生率高達(dá)38.2%。在小鼠和人類中，睡眠量受遺傳因素的制約，并表現(xiàn)出與年齡有關(guān)的變化，但對于調(diào)節(jié)哺乳動物睡眠時間的核心分子途徑和效應(yīng)機制仍不清楚。

  北京生命科學(xué)研究所劉清華團(tuán)隊通過對小鼠的研究，發(fā)現(xiàn)了調(diào)控小鼠睡眠時間的關(guān)鍵信號通路，闡明了睡眠時間受轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制，幫助人們理解人類的睡眠異常現(xiàn)象，并為修復(fù)或調(diào)整睡眠提供指導(dǎo)。相關(guān)論文于2022年12月7日發(fā)表在《Nature》雜志上。

研究人員通過用重組AAV-PHP.eB病毒對Lkb1^flox/flox成年小鼠進(jìn)行眼眶后注射，建立腦嵌合體（ABC）模型（含有人突觸素（hSyn）啟動子的Cre重組酶表達(dá)系統(tǒng)），并對成年鼠腦嵌合體的Lkb1基因（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因）進(jìn)行敲除（ABC-Lkb1^KO）。HA-Cre（含血凝素標(biāo)簽蛋白的Cre）和LKB1的免疫染色證實了在ABC-Lkb1^KO小鼠的不同腦區(qū)，有60-99%的表達(dá)Cre的神經(jīng)元出現(xiàn)了LKB1表達(dá)的缺失。通過免疫印跡發(fā)現(xiàn)，與表達(dá)mCherry（紅色熒光蛋白）的Lkb1^flox/flox小鼠相比，表達(dá)Cre的ABC-Lkb1^KO小鼠的皮層裂解物中LKB1蛋白的水平降低了約75%，同時睡眠時間也減少了3小時以上。這說明LKB1是促進(jìn)睡眠的蛋白激酶（圖1）。

與此同時，研究人員觀察到，敲除Lkb1后，小鼠大腦SIK3（鹽誘導(dǎo)激酶3，能磷酸化 組蛋白脫乙?；?（HDAC4））的Thr221（T221）磷酸化水平下降約50%，而在攜帶模擬磷酸化的T221E突變的小鼠中持續(xù)激活SIK3蛋白能夠部分恢復(fù)因LKB1缺失而減少的睡眠時間，這意味著LKB1-SIK3激酶級聯(lián)促進(jìn)睡眠。SIK3通過對HDAC4的S245或HDAC5的等效殘基的磷酸化和細(xì)胞質(zhì)隔離抑制HDAC4/5活性。研究人員構(gòu)建了將HDAC4/5的N-末端轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域（H4N/H5N）與VP16的反式激活結(jié)構(gòu)域結(jié)合的融合蛋白（H4N-VP16/H5N-VP16），可以干擾培養(yǎng)細(xì)胞中內(nèi)源性HDAC4/5的轉(zhuǎn)錄活性。H4N-VP16和H5N-VP16的ABC共表達(dá)完全恢復(fù)了ABC-Lkb1^KO 小鼠中的NREMS量和δ功率（衡量睡眠深度的標(biāo)準(zhǔn)）。結(jié)果表明LKB1-SIK3通路通過抑制HDAC4/5的活性來促進(jìn)睡眠。

圖1. LKB1-SIK3信號通過抑制HDAC4/5調(diào)節(jié)非快動眼睡眠（NREMS）

為了確定HDAC4/5在小鼠大腦中調(diào)節(jié)睡眠的位置，研究人員在C57BL/6J小鼠的丘腦（THA）、視前區(qū)（POA）或下丘腦后部（PH）立體定向注射AAV-hSyn-HDAC4^CN（CN：細(xì)胞核）或AAV-hSyn-H4N/H5N-VP16。通過睡眠-覺醒的視頻分析，由AAV介導(dǎo)的HDAC4（CN）或H4N-VP16/H5N-VP16在THA或POA中的表達(dá)，沒有觀察到睡眠表型。相比之下，在下丘腦后部HDAC4（CN）的表達(dá)減少了每日睡眠量，H4N-VP16/H5N-VP16的表達(dá)顯著增加了每日睡眠量。結(jié)果表明，HDAC4/5在下丘腦后部調(diào)控睡眠時間，并且可能在全新的調(diào)控睡眠-覺醒腦區(qū)發(fā)揮功能。HDAC4/5不能直接與DNA結(jié)合，其通過調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子（包括：MEF2、FOXO和CREB）的活性來發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。研究人員通過篩選發(fā)現(xiàn)，與HDAC4/5相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子CREB也能抑制睡眠。為了研究HDAC4和CREB之間的功能關(guān)系，研究人員通過在C57BL/6J小鼠中HDAC4（CN）和A-CREB（CREB轉(zhuǎn)錄活性抑制劑）的ABC共表達(dá)進(jìn)行上位性分析。血凝素、T7（蛋白標(biāo)簽）和NeuN（能特異性的與神經(jīng)元細(xì)胞核的抗原結(jié)合，在正常腦組織的椎體神經(jīng)元和顆粒性神經(jīng)元表達(dá)）的共免疫染色顯示，小鼠大腦中70%至90%的AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元共表達(dá)HDAC4（CN）-HA和A-CREB-T7。?與ABC-HDAC4（CN）和mCherry的ABC共表達(dá)相比，HDAC4（CN）和A-CREB的ABC共表達(dá)導(dǎo)致每日NREMS量平均增加約318分鐘，而不改變NREMS的δ功率，因此，HDAC4（CN）依賴CREB調(diào)節(jié)NREMS量（圖2）。

圖2. HDAC4（CN）以CREB依賴的方式調(diào)節(jié)NREMS量

接下來，通過轉(zhuǎn)錄組分析和ChIP-seq分析發(fā)現(xiàn)，HDAC4和CREB可能結(jié)合在相同靶基因的同一位置，并且同向調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平。研究人員在Sleepy突變小鼠中表達(dá)HDAC4^CN或CREB均能回補其嗜睡表型，同時也能恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄變化，這說明HDAC4/5和CREB位于SIK3激酶下游協(xié)同調(diào)節(jié)睡眠。這一研究結(jié)果首次揭示了調(diào)控小鼠睡眠時間的核心分子通路：LKB1-SIK3-HDAC4/5-CREB（圖3）。

圖3. 調(diào)控睡眠的分子通路模型

現(xiàn)今，睡眠問題越來越年輕化，已然成為全球尤為關(guān)注的問題，了解睡眠的調(diào)控機制可以幫助我們理解睡眠缺陷與睡眠疾病，并能做出對應(yīng)的診斷和治療。

云克隆開發(fā)了上述研究中涉及到的相關(guān)靶標(biāo)產(chǎn)品，靶標(biāo)及核心貨號如下，供參考：