自閉癥，又稱孤獨(dú)癥或孤獨(dú)性障礙，是一類發(fā)生于兒童早期的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，以社交溝通障礙、興趣狹隘、行為重復(fù)刻板為主要特征，嚴(yán)重影響兒童社會功能和生活質(zhì)量。自閉癥通常起病于嬰幼兒期，缺乏有效治療藥物，主要治療途徑為康復(fù)訓(xùn)練，最佳治療期為6歲前，越早干預(yù)效果越好。

自閉癥的診斷沒有“金標(biāo)準(zhǔn)”，目前在我國處于“三缺”狀態(tài)：缺乏統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)、缺乏掌握診斷技術(shù)的專業(yè)人員、缺乏清晰的康復(fù)路徑。那么，如何盡早對自閉癥患兒做出診斷呢？為了深度挖掘自閉癥患兒背后的致病機(jī)理，科學(xué)家們利用基因編輯等手段構(gòu)建出多種自閉癥小鼠模型，通過行為學(xué)測試來觀察小鼠的社交行為和刻板行為表現(xiàn)等，這也是目前為止公認(rèn)最有效的自閉癥研究方式。

武漢云克隆可提供針對自閉癥行為一系列特征的行為學(xué)檢測：

1. 社交溝通障礙行為學(xué)檢測

三箱社交實(shí)驗(yàn)

原理：三箱社交行為檢測的主要原則是基于受試小鼠在實(shí)驗(yàn)期間自由選擇在三個(gè)盒子的隔間中的任何一個(gè)中花費(fèi)的時(shí)間。

步驟：

2 將空小鼠籠（金屬籠）分別放在左右室中間；

2 將待測試小鼠放在三箱社交箱中間部位，并讓其自由適應(yīng)5分鐘，放回籠中；

2 將一只或兩只“不熟悉”小鼠放在一邊的小鼠籠中，另一端的小鼠籠空著；

2 然后立即將待測試小鼠放回三箱社交箱的中間部位，讓其自由活動5分鐘。

2 5分鐘期間，測試小鼠的活動將由攝像機(jī)自動記錄。

測試數(shù)據(jù)：每只受試小鼠在測試5分鐘階段處于“intruder zone”和“empty zone”的時(shí)間，社交反應(yīng)指數(shù)=（intruder zone時(shí)間-empty zone時(shí)間）/（intruder zone時(shí)間+empty zone時(shí)間）。

備注：intruder zone：有“不熟悉”小鼠籠子的區(qū)域；empty zone：空籠子的區(qū)域。

圖1. 三箱社交行為學(xué)檢測設(shè)備

2. 學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)檢測

2.1 避暗實(shí)驗(yàn)

原理：利用嚙齒動物的嗜暗的習(xí)性設(shè)計(jì)一個(gè)裝置，一半是暗室，一半是明室，中間有一小洞相連，暗室底部鋪有通電的銅柵，小鼠進(jìn)入暗室即受到電擊。主要測試動物對明暗辨別覺的學(xué)習(xí)記憶能力。

步驟：

2 將小鼠面部背向洞口放入明室，同時(shí)啟動計(jì)時(shí)器；

2 動物穿過洞口進(jìn)入暗室受到電擊，計(jì)時(shí)器自動停止，取出小鼠，記錄每只小鼠從放入明室至進(jìn)入暗室遭電擊所需的時(shí)間，此即潛伏期，訓(xùn)練5min，并記錄5min內(nèi)電擊次數(shù)；

2 24h后重作測驗(yàn)，記錄每只動物進(jìn)入暗室的潛伏期和5min 內(nèi)的電擊次數(shù)，并計(jì)算5min內(nèi)進(jìn)入暗室（錯(cuò)誤反應(yīng)）的動物百分率；

2 以上實(shí)驗(yàn)步驟為記憶獲得過程。停止訓(xùn)練5天后進(jìn)行一次或多次記憶消退實(shí)驗(yàn)（即記憶再現(xiàn)過程）。

測試數(shù)據(jù)：潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)、明箱逗留時(shí)間、暗箱逗留時(shí)間、明箱活動路程、暗箱活動路程等；

圖2. 避暗實(shí)驗(yàn)及明暗箱/黑白箱實(shí)驗(yàn)檢測設(shè)備

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

原理：實(shí)驗(yàn)動物被強(qiáng)迫在水箱內(nèi)游泳，觀察并記錄動物尋找到隱藏在水下平臺所需的時(shí)間、游泳軌跡及其采用的策略，分析和推斷動物的學(xué)習(xí)、記憶和空間定位等方面的能力。

步驟：

2 實(shí)驗(yàn)前一天，實(shí)驗(yàn)鼠自由游泳2min以熟悉環(huán)境，其間引導(dǎo)動物站上平臺10s，次日開始訓(xùn)練；

2 定位航行試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)鼠每次從1個(gè)象限的相同入水點(diǎn)入水，將動物面向池壁放入水中，儀器自動記錄動物尋找并爬上平臺的路線圖、動物從入水到找到水下隱蔽平臺并站立其上所需時(shí)間（逃避潛伏期）及游泳總路程。每完成4個(gè)象限的訓(xùn)練當(dāng)做1個(gè)循環(huán)，如果動物在90s內(nèi)未找到平臺，則需將其引至平臺，這時(shí)潛伏期以90s計(jì)，讓動物在平臺停留10s后，再放回籠中。如此重復(fù)完成4個(gè)象限的試驗(yàn)，總共訓(xùn)練5天，也就是四個(gè)循環(huán)，象限選擇和各實(shí)驗(yàn)組動物訓(xùn)練順序應(yīng)隨機(jī)確定或交叉進(jìn)行；

2 空間探索試驗(yàn)：定位航行試驗(yàn)結(jié)束5天后，將水下平臺撤除，按照定位航行試驗(yàn)的方法重復(fù)1個(gè)循環(huán)（共4個(gè)象限）的試驗(yàn)，動物每次從1個(gè)象限的入水點(diǎn)入水，記錄90s內(nèi)小鼠在水池4個(gè)象限中的游泳距離、路徑、時(shí)間，據(jù)此推算平臺所在象限數(shù)據(jù)占總距離、總時(shí)間的百分比及穿越平臺的次數(shù)，用來反映實(shí)驗(yàn)鼠對平臺所在位置的空間記憶能力，以判斷動物記憶儲存及提取再現(xiàn)能力。

測試數(shù)據(jù)：逃避潛伏期、上臺前游泳路程、平臺象限活動時(shí)間占總時(shí)間百分比、平臺象限活動路程占總距離百分比、站臺穿越次數(shù)等。

圖3. Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測設(shè)備

3. 焦慮與抑郁行為學(xué)檢測

3.1 曠場實(shí)驗(yàn)

原理：評價(jià)實(shí)驗(yàn)動物在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種方法。以實(shí)驗(yàn)動物在新奇環(huán)境之中某些行為的發(fā)生頻率和持續(xù)時(shí)間等，反應(yīng)實(shí)驗(yàn)動物在陌生環(huán)境中的自主行為與探究行為，以尿便次數(shù)反應(yīng)其緊張度。

步驟：

2 區(qū)域設(shè)置：按照實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置實(shí)驗(yàn)所需區(qū)域，一般有中央格、邊格、角格等，具體按實(shí)驗(yàn)需求設(shè)置；

2 識別參數(shù)設(shè)置：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇，一般選擇靜態(tài)背景法；

2 背景調(diào)節(jié)：看實(shí)驗(yàn)鼠的顏色，鼠色與背景色（一般黑背景）相差較遠(yuǎn)選擇較亮，相差較近選擇較暗；

2 設(shè)置閾值調(diào)節(jié)：根據(jù)鼠的顏色背景選擇，白鼠一般閾值上限到255，下限設(shè)在100-130左右，具體還是按照實(shí)時(shí)情況自己調(diào)節(jié)，這個(gè)跟燈光、鼠色、角度都有關(guān)系；

2 測試參數(shù)：設(shè)置為5min；

2 手動事件：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求一般手動記錄需要考察的數(shù)據(jù)包括站立、修飾等行為；

2 開始實(shí)驗(yàn)：將實(shí)驗(yàn)鼠放置于曠場正中央，點(diǎn)擊采集分析，添加新軌跡，點(diǎn)擊開始計(jì)算機(jī)記錄實(shí)驗(yàn)鼠的行為。

測試數(shù)據(jù)：水平運(yùn)動總距離（穿越方格總數(shù)）、中央?yún)^(qū)進(jìn)入總次數(shù)、中央?yún)^(qū)運(yùn)滯留時(shí)間、直立次數(shù)、糞便數(shù)量等。

圖4. 曠場實(shí)驗(yàn)檢測設(shè)備

3.2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

原理：利用動物對新異環(huán)境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突行為來考察動物的焦慮狀態(tài)。

步驟：

2 區(qū)域設(shè)置：設(shè)置區(qū)域?yàn)殚_臂1、開臂2、閉臂1、閉臂2、中央?yún)^(qū)；

2 識別參數(shù)設(shè)置：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇，一般選擇靜態(tài)背景法；

2 背景調(diào)節(jié)：看實(shí)驗(yàn)鼠的顏色，鼠色與背景色（一般黑背景）相差較遠(yuǎn)選擇較亮，相差較近選擇較暗；

2 設(shè)置閾值調(diào)節(jié)，根據(jù)鼠的顏色背景選擇，白鼠一般閾值上限到255，下限設(shè)在100-130左右，具體還是按照實(shí)時(shí)情況自己調(diào)節(jié)，這個(gè)跟燈光、鼠色、角度都有關(guān)系；

2 測試參數(shù)：一般設(shè)置為5min；

2 采集分析，添加軌跡，點(diǎn)擊開始記錄實(shí)驗(yàn)鼠的行為。

測試數(shù)據(jù)：

開臂進(jìn)入次數(shù)百分比＝開臂進(jìn)入次數(shù)/開臂進(jìn)入次數(shù)＋閉臂進(jìn)入次數(shù)

開臂滯留時(shí)間百分比＝開臂滯留時(shí)間/開臂滯留時(shí)間＋閉臂滯留時(shí)間

圖5. 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)檢測設(shè)備

3.3 明暗箱/黑白箱實(shí)驗(yàn)

原理：在明暗箱中，小鼠或大鼠喜歡在暗箱活動，但動物的探究習(xí)性促使其試圖去探究明箱。然而，明箱的亮光刺激又抑制動物在明箱的探究活動。將實(shí)驗(yàn)鼠放入照明的隔間中，并允許在兩個(gè)室之間自由移動。進(jìn)入暗室的第一個(gè)潛伏期和在亮室中花費(fèi)的總時(shí)間是實(shí)驗(yàn)鼠明亮空間焦慮的指標(biāo)。

步驟及測試指標(biāo)同避暗實(shí)驗(yàn)，明暗箱的設(shè)備同避暗實(shí)驗(yàn)，除可用于檢測實(shí)驗(yàn)動物的學(xué)習(xí)記憶能力外，主要也用于評價(jià)實(shí)驗(yàn)動物的焦慮行為。

3.4 糖水偏好實(shí)驗(yàn)

原理：嚙齒類動物天生對甜食有強(qiáng)烈的欲望，當(dāng)給它們提供可自由選擇即分別含有蔗糖溶液和普通水的兩個(gè)飲水裝置時(shí)，它們會有選擇地喝甜味的蔗糖溶液。然而，當(dāng)嚙齒類動物處于抑郁狀態(tài)時(shí)，它們不會傾向性去喝蔗糖溶液。

步驟：同時(shí)給實(shí)驗(yàn)動物提供糖水和常規(guī)水，在一段時(shí)間后記錄它們的飲水量。
測試數(shù)據(jù)：糖水和常規(guī)水的飲水量差異。

4. 刻板行為

嚙齒類動物刻板行為指的是一種固定而重復(fù)的行為模式，通常表現(xiàn)為一些無意義或無目的的動作，如反復(fù)地咬自己、追趕自己的尾巴、在同一位置不停地來回走動、強(qiáng)迫性地清潔自己或其他物品等。可直接通過觀察來記錄小鼠的刻板行為。

自閉癥的行為檢測，對臨床診斷和科學(xué)研究均具有重要意義。每種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)各有其優(yōu)勢和局限，綜合使用多種行為學(xué)檢測，為自閉癥早期診斷提供有效手段。云克隆可提供上述各類行為學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)，為自閉癥研究提供診斷依據(jù)。