含NLR家族pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白12（NLRP12）是較晚發(fā)現(xiàn)的一種NLRs家族蛋白，由位于19號(hào)染色體上的NLRP12基因編碼生成，分布于髓系細(xì)胞中，以中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞居多，同時(shí)也存在于腦、肺、脾等多種器官中。有相關(guān)研究表明NLRP12與核因子κB（NF-κB）等多種信號(hào)通路有關(guān)，抑制炎癥因子產(chǎn)生，進(jìn)而負(fù)向調(diào)控炎癥反應(yīng)。因此，NLRP12功能異常與多種炎癥疾病的發(fā)生相關(guān)。

近期，美國(guó)圣猶達(dá)兒童研究醫(yī)院的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)NLRP12是血紅素和病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）介導(dǎo)的PANoptosis（泛凋亡）、炎癥和病理的必需細(xì)胞溶質(zhì)感受器，表明NLRP12和該通路中的分子是溶血性和炎癥性疾病的潛在藥物靶點(diǎn)。相關(guān)研究結(jié)果于2023年6月1日發(fā)表在《Cell》期刊上，論文標(biāo)題為“NLRP12-PANoptosome activates PANoptosis and pathology in response to heme and PAMPs”。

血紅素在低血清條件下可激活NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，但在更多生理?xiàng)l件下涉及的細(xì)胞質(zhì)感受器和分子機(jī)制仍不清楚。實(shí)驗(yàn)人員向骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞（BMDMs）分別加入血紅素、Pam3（一種TLR2配體，是炎癥通路的強(qiáng)效激活劑）、LPS+ATP（誘導(dǎo)經(jīng)典NLRP3炎癥小體）以及血紅素+Pam3來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，并且觀察BMDMs的生化特征。與單獨(dú)使用血紅素或Pam3相比，使用LPS + ATP后炎癥小體被活化并且切割GSDMD（gasdermin D），使其形成P30片段與細(xì)胞膜結(jié)合，形成焦亡小孔，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞炎性死亡。與使用LPS+ATP相比，血紅素+Pam3處理后，未觀察到GSDMD的P30片段。但是可以看到凋亡的半胱天冬酶（caspase-8、caspase-3 和 caspase-7）更容易被活化，而caspase-3和caspase -7的激活可以切割GSDMD產(chǎn)生P20片段來(lái)使其失活。此外，還觀察到混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣假激酶（MLKL） 被磷酸化（pMLKL）以及GSDME（gasdermin E）因被裂解而激活，而活化的GSDME可在特定條件下誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。這些數(shù)據(jù)表明，來(lái)自血紅素+PAMPs處理的協(xié)同信號(hào)誘導(dǎo)了多種細(xì)胞死亡標(biāo)志物。這些標(biāo)志物證明細(xì)胞出現(xiàn)PANoptosis（泛凋亡），而不是單一的激活細(xì)胞焦亡、細(xì)胞凋亡或壞死性凋亡。

圖1  血紅素+PAMPs誘導(dǎo)炎性細(xì)胞死亡

圖片源自《Cell》雜志

因?yàn)檠t素+PAMPs組合可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，為了明確在釋放血紅素的溶血性疾病中哪些NLRPs有差異表達(dá)，研究人員分析了瘧疾或鐮狀細(xì)胞?。⊿CD）患者的公開數(shù)據(jù)集。結(jié)果顯示NLRP3、NLRP12在這些樣本中被高度上調(diào)，NLRP6僅在瘧疾患者的CD71⁺骨髓細(xì)胞中顯著上調(diào)，而NLRP2和NLRP1沒(méi)有上調(diào)。為了確定這些上調(diào)的NLRPs是否在血紅素參與的炎癥細(xì)胞死亡中發(fā)揮作用，研究人員評(píng)估了用血紅素+Pam3刺激的NLRP12、NLRP3和NLRP6缺陷型BMDMs中的細(xì)胞死亡情況。在加血紅素+Pam3的野生型（WT）和Nlrp6^?/?BMDMs中發(fā)生了相似水平的細(xì)胞死亡。Nlrp3^?/?BMDMs中細(xì)胞死亡水平降低，而Nlrp12^?/?BMDMs中細(xì)胞死亡最少。這些數(shù)據(jù)表明，在小鼠和人類細(xì)胞中，NLRP12是血紅素+PAMPs驅(qū)動(dòng)炎癥細(xì)胞死亡所必需的。接下來(lái)，研究人員確定了NLRP12的缺失如何在分子水平上影響細(xì)胞死亡。在使用血紅素+Pam3處理的情況下，與野生型BMDMs相比，Nlrp12^{- /-} BMDMs中caspase-1、GSDMD（尤其是P20形式）、GSDME、caspase-8、caspase-3和caspase-7的切割減少，MLKL的磷酸化減少，這表明NLRP12調(diào)節(jié)炎癥小體和炎癥細(xì)胞死亡分子的激活，以控制血紅素+PAMPs誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

圖2  NLRP12調(diào)節(jié)由血紅素+PAMPs誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞死亡

圖片源自《Cell》雜志

除了炎癥小體之外，研究人員還觀察到caspase-8在NLRP12介導(dǎo)血紅素+PAMPs的炎癥細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用。用血紅素+Pam3處理WT、Nlrp12^-/-和Pycard^-/-BMDMs后的免疫沉淀顯示在WT BMDMs中形成了含有ASC（凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白）、RIPK3（受體相互作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3）、caspase-8和NLRP3的多蛋白PANoptosome復(fù)合物。而在沒(méi)有NLRP12的情況下，這種復(fù)合物的形成受到阻礙。由此可以看出炎癥小體是這種多蛋白PANoptosome復(fù)合物的組成部分，通過(guò)血紅素+PAMPs的刺激驅(qū)動(dòng)炎癥細(xì)胞死亡。為了進(jìn)一步證實(shí)NLRP12是PANoptosome的一部分，研究人員在293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)人NLRP12、NLRP3、ASC、caspase-8和RIPK3，并使用ASC和NLRP12蛋白作為誘餌進(jìn)行免疫沉淀。再次鑒定出了包含ASC、NLRP12、NLRP3、caspase-8和RIPK3的多蛋白復(fù)合物，并且在沒(méi)有NLRP3的情況下仍然形成復(fù)合物。由此可見，在血紅素+PAMPs的刺激下，NLRP12形成了一個(gè)包含炎癥小體和caspase-8以及其他細(xì)胞死亡分子的PANoptosome來(lái)執(zhí)行細(xì)胞死亡。

圖3  NLRP12與細(xì)胞死亡分子形成PANoptosome來(lái)執(zhí)行細(xì)胞死亡

圖片源自《Cell》雜志

為了進(jìn)一步了解NLRP12表達(dá)的調(diào)控及其與疾病病理學(xué)的關(guān)系，研究人員測(cè)量了BMDMs中NLRP12的表達(dá)水平。血紅素+PAMPs和血紅素+TNF-α處理后NLRP12的表達(dá)顯著上調(diào)。此外，NLRP12的表達(dá)在處理后12或24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有變化，但是在36小時(shí)時(shí)間點(diǎn)增加。與NLRP12表達(dá)的時(shí)間一致，細(xì)胞死亡開始于處理后30-32小時(shí)，表明NLRP12的表達(dá)與細(xì)胞死亡相關(guān)。此外，NLRP12的表達(dá)僅在用血紅素+PAMPs或血紅素+TNF-α聯(lián)合處理的BMDMs中增加，在單獨(dú)用血紅素、Pam3、LPS或TNF-α處理的BMDMs中沒(méi)有增加，表明血紅素+PAMPs或血紅素+TNF-α共同介導(dǎo)NLRP12表達(dá)所需的信號(hào)傳導(dǎo)。通過(guò)分析來(lái)自溶血性疾病患者的公開單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)與來(lái)自健康對(duì)照骨髓的細(xì)胞相比，在β地中海貧血或SCD患者的髓系和造血干細(xì)胞以及在β地中海貧血患者的紅系細(xì)胞中，NLRP12表達(dá)增加。這些結(jié)果表明NLRP12在多種細(xì)胞類型中的表達(dá)與溶血性疾病有關(guān)。

圖4  NLRP12參與溶血性疾病細(xì)胞的PANoptosis

圖片源自《Cell》雜志

研究結(jié)果表明NLRP12負(fù)責(zé)血紅素+PAMPs介導(dǎo)的炎癥小體和PANoptosome的激活，以驅(qū)動(dòng)炎癥細(xì)胞死亡。因此，靶向NLRP12或其他PANoptosome成分以及炎癥細(xì)胞死亡分子可能在各種感染和炎癥性疾病中具有較大的治療潛力。

云克隆開發(fā)了上述研究中涉及的相關(guān)指標(biāo)的蛋白、抗體、ELISA試劑盒等產(chǎn)品以助力相關(guān)疾病的研究，部分指標(biāo)節(jié)選如下，供參考：

靶標(biāo)核心    貨號(hào)

NF-kB      B824

NLRP3      K115

GSDMD      E529

Caspase 8    A853

Caspase 7    A449

MLKL       R645

RIPK3      E639

IL18       A064

IL1b       A563