2023年9月27日，德國(guó)巴特瑙海姆馬克斯·普朗克心肺研究所的研究團(tuán)隊(duì)在《Nature》期刊發(fā)表了題為“Inhibition of fatty acid oxidation enables heart regeneration in adult mice”的文章。該研究表明：抑制小鼠心肌細(xì)胞中脂肪酸氧化可提高對(duì)缺氧的抵抗力，刺激心肌細(xì)胞增殖，從而使缺血-再灌注損傷后的心臟再生。

大部分動(dòng)物的成體心臟之所以喪失再生能力，主要是因?yàn)樵诔錾蟛痪?，大多?shù)心肌細(xì)胞退出細(xì)胞周期，肥大性生長(zhǎng)。與此同時(shí)，心臟的心肌細(xì)胞能量代謝從糖酵解轉(zhuǎn)向脂肪酸氧化代謝，因?yàn)橹舅嵫趸@種氧化代謝方式產(chǎn)生能量的效率更高。由于高代謝活性，心肌細(xì)胞在出生后成熟伴隨著氧化DNA損傷，這也使心肌細(xì)胞難以分裂。因此，一旦發(fā)生心肌損傷，原有的心肌組織被瘢痕組織替代，就會(huì)導(dǎo)致心臟功能的永久性喪失。

研究團(tuán)隊(duì)希望從能量代謝方式的轉(zhuǎn)變中尋找心臟再生的方法，故構(gòu)建了αMHC-Cre ^pos/+;Cpt1b ^fl/fl小鼠（簡(jiǎn)稱Cpt1b ^cKO），該模型中Cpt1b在胚胎階段的心肌細(xì)胞中特異性失活，此基因?qū)π∈蟮闹舅嵫趸陵P(guān)重要。之后在Cpt1b基因敲除小鼠上構(gòu)建了缺血-再灌注（I-R）損傷模型，誘導(dǎo)小鼠心臟病發(fā)作。這種I-R損傷模型非常接近于病人接受冠狀動(dòng)脈梗阻而心臟被放置支架的情況。結(jié)果表明Cpt1b基因敲除組在I-R手術(shù)后4周，心臟功能大幅恢復(fù)，達(dá)到與損傷前幾乎相同的水平。研究者進(jìn)一步探究了Cpt1b基因失活后心肌細(xì)胞增殖背后的機(jī)制，在Cpt1b基因失活的小鼠心肌細(xì)胞中，α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，αKG）的水平增加了20倍。高水平的αKG導(dǎo)致KDM5酶活性顯著增加。激活KDM5能去甲基化心肌細(xì)胞識(shí)別基因，從而恢復(fù)這些基因的活性和表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖。  

這項(xiàng)科學(xué)突破，有望為心肌梗死等心臟病帶來(lái)全新治療方法。云克隆構(gòu)建了與該研究相關(guān)的心缺血再灌注小鼠模型，具體模型構(gòu)建方法如下：

1. 用3%戊巴比妥鈉80mg/kg腹腔注射麻醉，用小鼠剃毛器剃除小鼠胸部及腋下毛發(fā)（充分暴露手術(shù)區(qū)），用碘酒和75％乙醇手術(shù)區(qū)消毒。

2. 氣管插管：麻醉后，夾趾檢測(cè)無(wú)反應(yīng)即可進(jìn)行I-R手術(shù)。打開(kāi)外置光源、顯微鏡開(kāi)關(guān)，打開(kāi)呼吸機(jī)，設(shè)置好各參數(shù)（呼吸頻率110bpm），將氣管插管沿聲門插入氣管，取下小鼠接上呼吸機(jī)，觀察小鼠呼吸狀況，胸廓起伏與呼吸機(jī)頻率一致表示插管成功，即可進(jìn)行I-R手術(shù)。

3. 小鼠采用右側(cè)臥位，用眼科剪在左前肢腋下，用顯微剪于三、四肋間打開(kāi)胸腔充分暴露心臟，顯微直鑷輕輕夾起少量心包并于左心耳下撕開(kāi)少許心包，充分暴露左冠狀動(dòng)脈前降支（LAD）或所在區(qū)域。

4. 結(jié)扎冠狀動(dòng)脈：于顯微鏡下找到LAD走向或可能所在位置，持針器持取7-0帶針縫合線，于左心耳下緣2mm處進(jìn)針，縫線穿過(guò)LAD，以完全阻斷LAD血流，阻斷LAD血流30min，然后再灌注120min。

5. 關(guān)胸：結(jié)扎完成后，6-0縫線完全縫合胸腔開(kāi)口（保證無(wú)縫隙、無(wú)錯(cuò)位）關(guān)閉胸腔，由內(nèi)向外逐層縫合各層肌肉和皮膚。

6. 術(shù)后管理：術(shù)后密切關(guān)注小鼠狀態(tài)，有無(wú)呼吸異常等。待小鼠自然蘇醒后將小鼠從呼吸機(jī)上取下并取下氣管插管，正常飼養(yǎng)。

建模后6小時(shí)進(jìn)行模型鑒定，采用的是EB和TTC雙染法，具體實(shí)驗(yàn)方法如下：

1. 配制1.5%的Evans Blue染液、1% TTC染液備用。

2. 麻醉小鼠。

3. 將小鼠開(kāi)胸，迅速在小鼠心臟前降支血管原結(jié)扎位置處用7-0帶線縫合針進(jìn)行結(jié)扎。

4. 用止血鉗小心將升主動(dòng)脈鉗夾，從鉗夾處近心端小心緩慢注射Evans Blue 染液（25g小鼠約0.2mL）可觀察到小鼠心臟迅速變藍(lán)，結(jié)扎線以下變化不明顯。

5. 迅速分離出心臟后置于-20或-80 ℃冰箱保存。

6. 按以上步驟收集完所有心臟后，從冰箱中取出心臟，用刀片從心尖部逐層切片，每片約1 mm厚，切 5片。

7. 將切好的心臟片置于TTC染液中避光染色約10~20分鐘，取出后在體式顯微鏡下進(jìn)行拍照。

EB用于判定缺血區(qū)（不能被染成藍(lán)色），TTC染色判定梗死區(qū)（不能被染成紅色）。TTC染色原理是TTC和活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，生成紅色的甲臜，用來(lái)表示細(xì)胞的活力，是評(píng)價(jià)腦缺血損傷常用的指標(biāo)。心缺血再灌注小鼠EB-TTC染色結(jié)果圖如下：非缺血區(qū)呈藍(lán)色；梗死區(qū)為白色；而危險(xiǎn)區(qū)不會(huì)被染色，呈現(xiàn)原有的心肌顏色，為紅色。

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