細(xì)胞衰老是指對(duì)不同應(yīng)激因素的反應(yīng)而發(fā)生的不可逆轉(zhuǎn)的生長(zhǎng)停滯。衰老細(xì)胞分泌多種因子，統(tǒng)稱為衰老相關(guān)分泌表型（SASP），線粒體是SASP分泌的主要調(diào)節(jié)器。線粒體是細(xì)胞凋亡所必須的，細(xì)胞凋亡是一種不同于細(xì)胞衰老的細(xì)胞命運(yùn)，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，廣泛的線粒體外膜透化（MOMP）可介導(dǎo)細(xì)胞死亡。MOMP發(fā)生在線粒體的一個(gè)子集中，是細(xì)胞衰老的一個(gè)特征，這個(gè)過(guò)程稱為少數(shù)MOMP（miMOMP），需要BAX和BAK通道將線粒體DNA（mtDNA）釋放到胞漿中，胞漿mtDNA反過(guò)來(lái)激活cGAS-STING通路，這是SASP的主要調(diào)節(jié)因子，體內(nèi)抑制MOMP可以減少炎癥標(biāo)志物并改善老年小鼠的健康壽命。發(fā)表在《Nature》上的題為“Apoptotic stress causes mtDNA release during senescence and drives the SASP”的最新研究探討了衰老細(xì)胞和受損細(xì)胞導(dǎo)致炎癥的原因，揭開了衰老過(guò)程背后的一些生物學(xué)秘密，并提供了一種潛在的新型治療靶標(biāo)。

1. miMOMP是細(xì)胞衰老的一個(gè)典型特征

首先通過(guò)3D結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)（SIM）分析MOMP是否存在于衰老細(xì)胞中，檢測(cè)線粒體外膜蛋白TOM20和細(xì)胞色素c（Cyt c）在增殖和衰老的人成纖維細(xì)胞中的共定位關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)輻射誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞（Sen IR）外周部分線粒體中TOM20和Cyt c的共定位關(guān)系減弱，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，衰老細(xì)胞胞漿中Cyt c和cleaved caspase-3的含量增加且BAX被大量激活，這些數(shù)據(jù)都表明衰老期間部分線粒體會(huì)發(fā)生MOMP，研究團(tuán)隊(duì)將這一現(xiàn)象稱為miMOMP。

                                                                                                                        圖1. miMOMP發(fā)生在細(xì)胞衰老過(guò)程中

2. 衰老細(xì)胞中miMOMP導(dǎo)致胞漿mtDNA釋放增加

研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)衰老細(xì)胞中miMOMP可能釋放mtDNA入胞漿。通過(guò)TOM20和DNA的免疫熒光雙染色及透射電鏡觀察免疫膠體金標(biāo)記的DNA水平，結(jié)果均顯示衰老細(xì)胞中的胞漿DNA水平升高。接下來(lái)，則要明確這些升高的DNA是否來(lái)源于線粒體。通過(guò)qPCR檢測(cè)mtDNA標(biāo)志物（D-loop）的表達(dá)在衰老細(xì)胞胞漿中升高，并發(fā)現(xiàn)衰老細(xì)胞中大部分胞漿DNA與線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）共定位，TFAM是mtDNA類核的核心成分之一。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明衰老細(xì)胞中miMOMP胞漿mtDNA釋放增加。

                                                                                                                               圖2. 衰老細(xì)胞中miMOMP釋放mtDNA入胞漿

3. BAX和BAK體內(nèi)外促進(jìn)SASP的分泌

運(yùn)用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了同時(shí)敲除BAX和BAK的人成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)BAX和BAK的敲除顯著抑制了衰老細(xì)胞中mtDNA的釋放。進(jìn)一步研究BAX和BAK是否會(huì)影響SASP，進(jìn)行了RNA-seq分析及細(xì)胞因子陣列分析，發(fā)現(xiàn)BAX和BAK的敲除抑制了SASP相關(guān)基因的表達(dá)，并降低了促炎細(xì)胞因子水平。研究人員又探究BAX和BAK的敲除是否影響衰老相關(guān)細(xì)胞周期阻滯途徑，發(fā)現(xiàn)BAX和BAK敲除對(duì)細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子p21和p16的基因和蛋白表達(dá)高低無(wú)影響，也不影響衰老相關(guān)標(biāo)志物（SA-β-Gal和γH2A.X foci）、衰老相關(guān)的Lamin B1和HMGB1的表達(dá)、增殖標(biāo)志物等的表達(dá)。這些結(jié)果表明，miMOMP通過(guò)BAX和BAK促進(jìn)mtDNA釋放到胞漿并調(diào)控SASP，而不調(diào)控衰老相關(guān)細(xì)胞周期阻滯途徑。該結(jié)論進(jìn)一步在體內(nèi)被證實(shí)，借助于條件性敲除BAX鼠（Bax^fl/flBak^-/-）和BAX和BAK雙敲鼠（Bax^-/-Bak^-/-），Bax^-/-Bak^-/-鼠顯著抑制了小鼠肝臟促炎細(xì)胞因子表達(dá)，且肝臟中CD68⁺免疫細(xì)胞以及CD45⁺CD68⁺免疫細(xì)胞數(shù)量顯著下降，且不影響p16和p21基因表達(dá)，表明BAX和BAK可調(diào)控衰老小鼠肝臟SASP分泌，但不影響衰老相關(guān)細(xì)胞細(xì)胞周期變化。

                                                                                                               圖3. miMOMP通過(guò)BAX和BAK促進(jìn)mtDNA釋放到胞漿并調(diào)控SASP

4. mtDNA通過(guò)cGAS–STING調(diào)控SASP 

在細(xì)胞凋亡和其他應(yīng)激條件下，胞漿mtDNA激活cGAS-STING信號(hào)通路，且cGAS-STING信號(hào)調(diào)控SASP，然而關(guān)于胞漿mtDNA釋放、cGAS-STING與SASP調(diào)控三者之間的聯(lián)系的研究仍然缺乏。為了探究這一問(wèn)題，構(gòu)建了無(wú)線粒體細(xì)胞，即人成纖維細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)YFP-Parkin，并通過(guò)X射線輻照誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。穩(wěn)轉(zhuǎn)YFP-Parkin人成纖維衰老細(xì)胞，用線粒體解偶聯(lián)劑（CCCP）處理，引起衰老細(xì)胞中的線粒體自噬從而耗盡細(xì)胞中的線粒體，然后用分離純化的mtDNA轉(zhuǎn)染無(wú)線粒體的衰老細(xì)胞，ELISA結(jié)果顯示胞漿mtDNA水平的增加顯著促進(jìn)了無(wú)線粒體衰老細(xì)胞分泌的主要SASP因子IL-6和IL-8的增加。

                                                                                                                            圖4. mtDNA促進(jìn)衰老細(xì)胞分泌SASP

接下來(lái)探討mtDNA促進(jìn)SASP的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在衰老成纖維細(xì)胞中，GFP-cGAS融合蛋白與胞漿TFAM的共定位水平增加，利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除細(xì)胞中cGAS或STING，發(fā)現(xiàn)cGAS或STING的敲除顯著降低了衰老細(xì)胞SASP中IL-6和IL-8的分泌，而在野生型人成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mtDNA后，顯著促進(jìn)了衰老細(xì)胞SASP中IL-6和IL-8的分泌，這些數(shù)據(jù)表明mtDNA通過(guò)cGAS-STING調(diào)控SASP分泌。

                                                                                                                                  圖5. mtDNA通過(guò)cGAS–STING調(diào)控SASP的分泌

5. 抑制MOMP可改善健康壽命

接下來(lái)研究通過(guò)抑制MOMP是否能抑制mtDNA釋放和SASP分泌。研究團(tuán)隊(duì)使用BAX小分子抑制劑BAI1抑制BAX活性，結(jié)果顯示，經(jīng)BAI1處理的衰老人成纖維細(xì)胞胞漿mtDNA和SASP相關(guān)基因表達(dá)被顯著抑制。那么，抑制MOMP是否可以改善衰老相關(guān)的肌肉力量的下降呢？通過(guò)轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BAI1治療可改善與年齡相關(guān)的神經(jīng)肌肉協(xié)調(diào)能力下降，通過(guò)前肢握力實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BAI1治療可增強(qiáng)衰老小鼠的前肢握力，顯著改善與衰老相關(guān)的肌肉力量下降。鑒于BAI1處理的老年小鼠中觀察到的肌肉骨骼表現(xiàn)的改善，進(jìn)一步通過(guò)微計(jì)算機(jī)斷層掃描（μCT）分析來(lái)發(fā)現(xiàn)BAI1處理有效改善脊柱和股骨骨小梁微結(jié)構(gòu)，股骨體積分?jǐn)?shù)顯著升高。

                                                                                                                                        圖6. 抑制MOMP可改善健康壽命

以上研究結(jié)果說(shuō)明，細(xì)胞衰老和凋亡受到類似線粒體依賴性機(jī)制的調(diào)節(jié)，miMOMP可促進(jìn)mtDNA調(diào)控SASP分泌，抑制miMOMP誘導(dǎo)的炎癥可能是改善健康壽命的一種治療途徑。

云克隆開發(fā)了上述研究中涉及到的相關(guān)靶標(biāo)的蛋白、抗體以及試劑盒產(chǎn)品。靶標(biāo)及核心貨號(hào)如下，供參考：