2024年1月，哥倫比亞大學(xué)歐文醫(yī)學(xué)中心在《Cell》雜志發(fā)表題名為“SMARCAL1 is a dual regulator of innate immune signaling and PD-L1 expression that promotes tumor immune evasion”的文章，揭示SMARCAL1在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮的雙重作用，這可能是影響免疫檢查點抑制劑療效的關(guān)鍵因素。

DNA損傷反應(yīng)（DNA damage response，DDR）和染色質(zhì)調(diào)節(jié)在維持基因組穩(wěn)定性和控制基因表達方面發(fā)揮重要作用。近來有些關(guān)于腫瘤的研究表明，上調(diào)其DDR或染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子可以誘導(dǎo)固有免疫信號來增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。基于這一猜想，研究人員使用人三陰性乳腺癌細(xì)胞系（MDA-MB-436），構(gòu)建了基于熒光激活細(xì)胞分選的CRISPR-Cas9篩選方法。根據(jù)sgRNA的多重比較分析結(jié)果，研究人員篩選到PD-L1、IRF3、CTCF、RAD21、SMARCAL1、SMC3等一系列靶標(biāo)（見圖1）。

圖1. 在乳腺癌細(xì)胞系中進行的基于FACS的CRISPR-Cas9基因篩選

（圖片來自《Cell》雜志）

SMARCAL1是參與DNA復(fù)制與修復(fù)過程的酶，在細(xì)胞面對復(fù)制壓力時有助于保持基因組穩(wěn)定性，還能調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄水平。為了驗證SMARCAL1基因缺失對PD-L1和IRF3表達水平的影響，研究人員構(gòu)建了敲除SMARCAL1基因（SMARCAL1-KO）的MDA-MB-436細(xì)胞系。免疫印記和流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，SMARCAL1-KO的MDA-MB-43細(xì)胞PD-L1蛋白表達水平降低，IRF3磷酸化水平上調(diào)。這些結(jié)果表明SMARCAL1缺失下調(diào)PD-L1表達水平的的同時還能誘導(dǎo)PD-L1的活化。為了評估SMARCAL1基因缺失對免疫功能的影響，研究人員使用PLATE-seq和VIPER算法對SMARCAL1-KO的細(xì)胞進行分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期控制通路下調(diào)，IFN依賴信號途徑和細(xì)胞固有免疫信號上調(diào)。另外，SMARCAL1-KO細(xì)胞IFNA、IFNB1、CXCL10、SAMD9等基因的轉(zhuǎn)錄水平降低，STAT1磷酸化水平增加，CXCL1、CSF-3、CD54、IL1a、IL1b、IL6、IL8、IL32a、MIF、SERPINE1等蛋白的表達水平上調(diào)。SMARCAL1突變可致人schimke免疫骨發(fā)育不全（SIOD）。研究人員在來自SIOD患者的成纖維細(xì)胞和SMARCAL1-KO的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上觀察到干擾素和干擾素刺激基因的表達上調(diào)，這說明SMARCAL1缺失可以在人和小鼠細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞固有的先天免疫信號傳導(dǎo)。進一步基因表達分析顯示，由于CD274基因的轉(zhuǎn)錄水平降低，從而導(dǎo)致PD-L1蛋白的表達水平下調(diào)。這種現(xiàn)象不僅發(fā)生在乳腺癌細(xì)胞系，前列腺癌細(xì)胞系（PC3）、卵巢癌細(xì)胞系（PEO1）和骨肉瘤細(xì)胞系（U2OS）等細(xì)胞系也觀察到相同的情況（見圖2）。上述研究結(jié)果提示，SMARCAL1缺失導(dǎo)致的PD-L1蛋白表達水平下調(diào)可在多種人類腫瘤細(xì)胞中發(fā)生，同時這種情況的發(fā)生不依賴于IFN途徑。

圖2. SMARCAL1缺失時PD-L1表達水平和腫瘤先天免疫分析

（圖片來自《Cell》雜志）

考慮到SMARCAL1基因在維持基因組穩(wěn)定性方面的作用，研究人員猜想SMARCAL1基因缺失腫瘤細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)變化可能和基因組的不穩(wěn)定性有關(guān)。研究人員在SMARCAL1-KO細(xì)胞上觀察到DNA自發(fā)斷裂增加，gH2AX病灶和微核增加。更重要的是，SMARCAL1缺失增加了細(xì)胞內(nèi)的cGAMP水平。cGAMP是一種由cGAS合成的環(huán)狀二核苷酸，可激活STING和IRF3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。使用細(xì)胞周期酶抑制劑處理SMARCAL1-KO腫瘤細(xì)胞后，微核形成減少，IL6、CXCL10等細(xì)胞因子的表達水平降低。SMARCAL1-KO腫瘤細(xì)胞中cGAS微核陽性細(xì)胞比例增加。在腫瘤細(xì)胞中，微核形成或細(xì)胞質(zhì)DNA積累可激活cGAS-STING通路。此外，SMARCAL1缺失還增強了cGAS合成的2′3′-cGAMP水平，激活了STING和IRF3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。cGAS或STING的缺失會降低SMARCAL1缺陷細(xì)胞中的免疫基因表達。以上結(jié)果表明，SMARCAL1缺失導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)在免疫信號的上調(diào)是依賴于cGAS-STING信號途徑實現(xiàn)的。

圖3. SMARCAL1缺失細(xì)胞的內(nèi)部免疫信號分析

（圖片來自《Cell》雜志）

為了了解SMARCAL1是如何對PD-L1蛋白的表達產(chǎn)生影響的，研究人員首先監(jiān)測了DNA損傷治療后的SMARCAL1蛋白表達水平。和預(yù)期的一樣，DNA損傷增加了野生型和SMARCAL1-KO細(xì)胞的PD-L1蛋白的表達水平，這提示SMARCAL1缺失下調(diào)PD-L1的表達不是依賴于DNA損傷實現(xiàn)的?？紤]到SMARCAL1在重塑細(xì)胞復(fù)制中的作用，研究人員對影響細(xì)胞復(fù)制重塑因子（ZRANB3和HLTF）也進行了檢測，驗證他們的缺失是否也能促進PD-L1的表達，然而得到了否定的結(jié)果。接下來，研究人員對SMARCAL1基因進行CUT&RUN檢測，發(fā)現(xiàn)SMARCAL1基因所在的染色質(zhì)區(qū)域富含第4賴氨酸的甲基化組蛋白H3（H3K4me3）。H3K4me3是表觀遺傳學(xué)的生物標(biāo)志物，通常在基因的啟動子附近富集，并且與基因的轉(zhuǎn)錄相關(guān)，其水平可以反映轉(zhuǎn)錄的程度。最后研究人員對SMARCAL1和PD-L1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點分析，發(fā)現(xiàn)SMARCAL1通過直接轉(zhuǎn)錄控制PD-L1的表達水平（圖4）。

圖4. SMARCAL1蛋白對PD-L1蛋白表達水平的調(diào)控

（圖片來自《Cell》雜志）

為了明確SMARCAL1基因缺失對抗腫瘤免疫反應(yīng)的影響，研究人員使用黑色素瘤細(xì)胞皮下接種C57小鼠進行實驗。和對照組相比，SMARCAL1缺失顯著抑制腫瘤生長，延長小鼠生存期。重要的是，這種影響是由于細(xì)胞抗腫瘤免疫的增強，而非細(xì)胞生長受損。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，SMARCAL1-KO腫瘤內(nèi)的CD45⁺、CD8⁺、CD4⁺陽性細(xì)胞的數(shù)量增加。在使用CD8抗體治療后，注射SMARCAL1-KO細(xì)胞系的小鼠腫瘤體積顯著縮小，生存時間延長（表5）。這些研究表明，SMARCAL1缺失可增強腫瘤免疫原性和細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤排斥反應(yīng)。

圖5. SMARCAL1缺失腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答分析

（圖片來自《Cell》雜志）

綜上所述，SMARCAL1基因不僅可以直接從轉(zhuǎn)錄水平促進腫瘤細(xì)胞PD-L1基因的表達，幫助其實現(xiàn)免疫逃避，也能限制內(nèi)源性DNA損傷，從而抑制癌癥細(xì)胞生長過程中的cGAS-TING依賴性信號傳導(dǎo)，達到增強先天免疫及免疫細(xì)胞對腫瘤的浸潤的目的。這些研究表明，SMARCAL1可能作為癌癥免疫治療的潛在的靶點。

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