睡眠對(duì)于絕大多數(shù)動(dòng)物來說都是不可或缺的，睡眠不足會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的生理和病理后果，甚至死亡。早在2007年，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）就把熬夜和晝夜節(jié)律打亂的行為定義為2A類致癌物。然而，目前關(guān)于睡眠調(diào)節(jié)免疫力的內(nèi)在機(jī)制以及睡眠不足對(duì)健康的不良影響機(jī)制尚未得以闡明。不久前，來自清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院的團(tuán)隊(duì)在《Cell》上發(fā)表了題為“Prolonged sleep deprivation induces a cytokine-storm-like syndrome in mammals”的文章。他們研發(fā)出的“水箱睡眠剝奪“模式，使小鼠能在96%的時(shí)間內(nèi)保持清醒。研究發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪增加了大腦中前列腺素D2（PGD2）的水平，由ATP結(jié)合盒亞家族C4轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABCC4）介導(dǎo)的PGD2穿過血腦屏障（BBB）的流出量升高會(huì)誘導(dǎo)循環(huán)中性粒細(xì)胞的積累和細(xì)胞因子風(fēng)暴樣綜合征。而PGD2/DP1軸的實(shí)驗(yàn)性破壞能顯著減少睡眠剝奪引起的炎癥。這項(xiàng)研究揭示了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中PGD2與睡眠相關(guān)的變化會(huì)對(duì)周圍免疫系統(tǒng)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的病理影響。

圖1. 概要圖

（圖片源自《Cell》）

首先，研究者建立了一種新的小鼠睡眠剝奪（SD）系統(tǒng)，命名為CPW模式。該模式可持續(xù)剝奪小鼠96%以上的睡眠。為了檢驗(yàn)延長SD的生理后果，作者將成年小鼠置于CPW模式下。在短短4天的時(shí)間內(nèi)，80%的SD小鼠經(jīng)歷了在SD開始后72h-96h過早死亡。SD小鼠病理檢查顯示多系統(tǒng)臟器損傷，包括肝臟、脾臟、肺、腸和腎。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)揭示了長期的SD會(huì)導(dǎo)致危及生命的多器官功能障礙綜合癥（MODS）。

圖2. 長時(shí)間的睡眠剝奪會(huì)導(dǎo)致小鼠全身炎癥和過早死亡

（圖片源自《Cell》）

在人類中，細(xì)胞因子風(fēng)暴的特征是促炎細(xì)胞因子的過度釋放，并可導(dǎo)致器官損傷、發(fā)病率和死亡率升高。由于SD小鼠表現(xiàn)出器官損傷和炎癥特征，研究者推測它們可能遭受了細(xì)胞因子風(fēng)暴的病理后果。為了研究這一動(dòng)態(tài)，他們檢測了SD后小鼠血清中27種促炎細(xì)胞因子和趨化因子的水平，結(jié)果表明，隨著時(shí)間推移，大多數(shù)促炎因子上調(diào)。值得注意的是，IL-6和IL-17A是SD誘導(dǎo)變化最顯著的促炎細(xì)胞因子，而這兩種因子恰好也是介導(dǎo)人類細(xì)胞因子風(fēng)暴的主要炎癥因子。為了研究SD誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生的機(jī)制，研究者在SD過程中對(duì)小鼠血液白細(xì)胞進(jìn)行了RNA測序分析，轉(zhuǎn)錄組比較分析表明，細(xì)胞因子的產(chǎn)生隨著SD的進(jìn)展而增強(qiáng)，并且不同亞型的白細(xì)胞對(duì)SD表現(xiàn)出不同的反應(yīng)。結(jié)合MODS表型，這些結(jié)果表明SD在小鼠中引發(fā)了細(xì)胞因子風(fēng)暴樣綜合征。研究者進(jìn)一步比較了細(xì)胞因子在SD誘導(dǎo)死亡中的作用，SD小鼠給予抗細(xì)胞因子風(fēng)暴劑，用這些藥物治療的小鼠對(duì)SD誘導(dǎo)的死亡產(chǎn)生明顯抗性。對(duì)免疫缺陷小鼠的研究也表明，這些小鼠在SD 96h后都存活下來?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明，SD誘導(dǎo)的死亡可以通過抑制促炎細(xì)胞因子信號(hào)通路來預(yù)防。

圖3. 睡眠剝奪會(huì)誘發(fā)血液中促炎細(xì)胞因子的積累

（圖片源自《Cell》）

由于測序數(shù)據(jù)顯示，中性粒細(xì)胞相關(guān)基因在SD 24h后上調(diào)，研究者接下來對(duì)對(duì)照組、SD 24h和SD 48h小鼠進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序分析，以探究SD誘導(dǎo)的白細(xì)胞亞群的變化。結(jié)果顯示中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的比例在SD 24h上調(diào)，而淋巴細(xì)胞的比例則相反。這與前面RNA測序的結(jié)果一致。對(duì)中性粒細(xì)胞在SD 24h和SD 48h上調(diào)的基因進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞脫顆粒、中性粒細(xì)胞和細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫信號(hào)通路等的富集。這些結(jié)果表明，SD期間循環(huán)中性粒細(xì)胞積聚并被激活，可能是由細(xì)胞因子信號(hào)通路介導(dǎo)的。為了評(píng)估循環(huán)中性粒細(xì)胞對(duì)SD誘導(dǎo)死亡的貢獻(xiàn)，研究者通過腹腔內(nèi)注射抗Ly6G抗體來耗盡中性粒細(xì)胞。與同型對(duì)照相比，中性粒細(xì)胞耗竭的小鼠確實(shí)表現(xiàn)出對(duì)SD誘導(dǎo)的死亡的抵抗力。

圖4. 循環(huán)中性粒細(xì)胞的積累導(dǎo)致了睡眠剝奪導(dǎo)致的死亡

（圖片源自《Cell》）

接下來，作者探究了SD誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)是否需要跨BBB的轉(zhuǎn)運(yùn)。使用普通ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物羅丹明 B（RHB）進(jìn)行了體內(nèi)外排實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估BBB內(nèi)皮細(xì)胞中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性。結(jié)果表明，SD小鼠的晝夜節(jié)律振蕩明顯減弱，外排增強(qiáng)。此外，通過體外ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白流出實(shí)驗(yàn)也同樣觀察到此現(xiàn)象，說明大腦影響SD誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)不是通過交感神經(jīng)系統(tǒng)，而是通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的BBB外排。

圖5. 睡眠剝奪期間由ABCC轉(zhuǎn)運(yùn)體經(jīng)由血腦屏障的外排增強(qiáng)引起全身炎癥

（圖片源自《Cell》）

由于PGD2是最有效的內(nèi)源性睡眠促進(jìn)物質(zhì)之一，腦源性GPD2主要由脂鈣蛋白型PGD合成酶（PTGDS或L-PGDS）產(chǎn)生。隨后，作者通過靜脈注射G蛋白偶聯(lián)受體DP1和DP2激動(dòng)劑來模擬血液中PGD2水平的增加，以驗(yàn)證腦源性PGD2是否會(huì)引發(fā)SD誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DP1激動(dòng)劑導(dǎo)致靜息小鼠血液中中性粒細(xì)胞的比例呈劑量依賴性增加。表明PGD2在SD期間介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起了作用。通過基于GPCR激活的（GRAB）傳感器監(jiān)測SD期間大腦中的PGD2水平，發(fā)現(xiàn)該熒光傳感器對(duì)PGD2有特異性響應(yīng)。且SD 24h小鼠大腦中PGD2的水平和對(duì)照組相比升高了158%，表明SD升高了大腦中PGD2的水平。

圖6. 睡眠剝奪期間大腦中PGD2水平增加

（圖片源自《Cell》）

為了研究PGD2外排是否隨著SD的增加而增加，作者采用腦外排指數(shù)（BEI）進(jìn)行測定。結(jié)果表明，SD 24h、SD 48h和對(duì)照小鼠在SD期間的PGD2通過BBB的外排顯著增加。且腦源性PGD2的外排在Abcc4^-/-小鼠中被阻斷，從而防止SD誘導(dǎo)的死亡。與WT對(duì)照組相比，SD 48h處理的Abcc4^-/-小鼠的循環(huán)促炎癥細(xì)胞因子，特別是IL-6和循環(huán)中性粒細(xì)胞水平也有所降低。對(duì)PDG合成酶的敲除實(shí)驗(yàn)表明，與非靶向（NT）對(duì)照小鼠相比，SD 48h時(shí)Ptgds^BKO（腦嵌合KO）小鼠的循環(huán)中性粒細(xì)胞和血清IL-6誘導(dǎo)減弱。此外，遺傳Ptgds^-/-（傳統(tǒng)KO）小鼠對(duì)SD誘導(dǎo)的死亡具有抗性。綜上所述，這些結(jié)果揭示了睡眠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的有效途徑。SD增強(qiáng)PGD2的BBB外排，從而引發(fā)全身性炎癥。

圖7. 睡眠不足會(huì)增加大腦中PGD2的分泌且長時(shí)間睡眠不足會(huì)引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴

（圖片源自《Cell》）

這一研究發(fā)現(xiàn)表明，從藥理學(xué)角度阻斷PGD2/DP1軸能有效降低SD誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。這為破解睡眠對(duì)健康影響相關(guān)的藥物開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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