2024年3月，阿爾伯特-愛因斯坦醫(yī)學(xué)院的研究人員在《 Nature》上發(fā)表了題“Formation of memory assemblies through the DNA-sensing TLR9 pathway”的文章，揭示了與記憶形成相關(guān)的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)記憶形成和DNA損傷及炎癥信號相關(guān)。

圖1. 恐懼情況下的腦部神經(jīng)元活動

（圖片來自《Nature》雜志）

研究團(tuán)隊通過給小鼠進(jìn)行短暫、溫和的電擊，形成對電擊事件的情境恐懼條件反射（contextual fear conditioning，CFC），并進(jìn)一步揭示CFC的形成機(jī)制。研究人員在電擊后24-48h對小鼠的頸背神經(jīng)元進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，441個基因的轉(zhuǎn)錄水平增加，其中炎癥和TLR信號通路相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平增加最為顯著。接下來，研究人員通過共定位染色實驗發(fā)現(xiàn)，囊泡標(biāo)志物LAMP2蛋白和TLR9蛋白的共同定位增加，揭示TLR9蛋白通過核內(nèi)體的運輸活動增加，這對于DNA的識別和NF-κB的激活有促進(jìn)作用。TLR9蛋白與cGAS-STING是核外DNA的主要傳感器。在無感染或DNA損傷凋亡的情況下，這些通路通常是沉默的；但在神經(jīng)元應(yīng)激狀態(tài)下，TLR9蛋白會對線粒體DNA片段的釋放做出反應(yīng)。為了確定核外是否具有TLR9激活潛能的dsDNA片段，研究人員收集了正常小鼠和經(jīng)過恐懼訓(xùn)練的小鼠的海馬組織，對核外dsDNA片段進(jìn)行了克隆和測序，和對照組相比，實驗組小鼠在CFC之后TLR9的假定激活因子的頻率從33%瞬時增加到77%（見圖1），證實CFC能顯著增加TLR9基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。研究者還使用檢測dsDNA或線粒體DNA的染料對原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物進(jìn)行了活細(xì)胞成像，以區(qū)分非線粒體和線粒體核外DNA，發(fā)現(xiàn)核外非線粒體移動DNA信號水平增加。

圖2. CFC后小鼠神經(jīng)元的DNA損傷和損傷后修復(fù)

（圖片來自《Nature》雜志）

已有研究證實，神經(jīng)元活動可以誘導(dǎo)短暫的DNA斷裂。但是這種斷裂發(fā)生在編碼基因的增強(qiáng)子中，并在數(shù)分鐘內(nèi)得到修復(fù)，不會影響神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)。為了研究CFC產(chǎn)生的核外dsDNA片段的來源，研究人員使用熒光信號標(biāo)記dsDNA斷裂結(jié)合磷酸組蛋白（γH2AX3），并使用圖譜或顆粒分析對信號進(jìn)行量化。結(jié)果顯示，在CFC發(fā)生數(shù)小時后，CA1核團(tuán)中具有明顯γH2AX病灶的神經(jīng)元總數(shù)顯著增加。雖然核病灶的數(shù)量隨后減少，但單個神經(jīng)元中出現(xiàn)了更大的γH2AX標(biāo)記病灶，并持續(xù)了6-96h。而標(biāo)記γH2AX蛋白的熒光信號在星形膠質(zhì)細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞中均未發(fā)現(xiàn)。與核包膜層黏連蛋白B1（LMNB1）的共標(biāo)記檢測顯示，在檢測到最大dsDNA斷裂時，一部分細(xì)胞核出現(xiàn)包膜破裂，同時在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)RNA富集區(qū)觀察到γH2AX蛋白信號，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是非活性TLR9的主要定位點。CFC發(fā)生1h后，核包膜破裂數(shù)量明顯增加。核周γH2AX信號與TLR9共定位標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，在某些神經(jīng)元中，γH2AX和dsDNA單獨或以復(fù)合物的形式從含有TLR9的核周部位的細(xì)胞核中釋放出來。在較晚的時間點（6-96h）發(fā)現(xiàn)的持續(xù)γH2AX信號直徑為4μm或更大，并與中心體標(biāo)記物γ-微管蛋白共定位，這表明γH2AX定位在中心體周圍，而不是dsDNA斷裂處（見圖2）。中心體是一種存在于大多數(shù)動物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的一種細(xì)胞器，對于協(xié)調(diào)細(xì)胞分裂至關(guān)重要。但在不分裂的神經(jīng)元中，受刺激的中心體參與了DNA修復(fù)周期，將單個神經(jīng)元組織成記憶群體。這表明所提出的中心體在分裂細(xì)胞中維持基因完整性的作用也適用于進(jìn)行記憶相關(guān)活動的成體神經(jīng)元。

圖3. 海馬細(xì)胞TLR9基因缺失導(dǎo)致情景記憶受損

（圖片來自《Nature》雜志）

為了進(jìn)一步明確炎癥是學(xué)習(xí)記憶的副作用還是有助于記憶的形成，研究人員構(gòu)建了敲除TLR9的神經(jīng)元細(xì)胞系，通過局部注射的方式誘導(dǎo)小鼠CA1背海馬神經(jīng)元TLR9基因缺失。和正常小鼠相比，TLR9基因缺失小鼠在多次測試中的凍結(jié)行為（freezing behaviour）顯著減少，這表明小鼠的情境記憶受損。在野生型小鼠的海馬中注射表達(dá)降低TLR9表達(dá)的shRNA，也能復(fù)制上述實驗的記憶缺失。由于病毒注射會引起星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，為了排除這一因素的影響，研究人員注射敲除TLR9的星形膠質(zhì)細(xì)胞后未發(fā)現(xiàn)小鼠CFC受到影響。小鼠使用TLR9拮抗劑后也出現(xiàn)相似的凍結(jié)行為，表明失去TLR9基因會妨礙長期記憶的形成（圖3）。

圖4. 海馬神經(jīng)元細(xì)胞TLR9基因缺失影響DDR，損害神經(jīng)元纖毛形成

（圖片來自《Nature》雜志）

為了明確TLR9基因缺失在細(xì)胞層面產(chǎn)生的影響，研究人員使用相同遺傳品系的小鼠，通過局部注射的方式分別誘導(dǎo)小鼠CA1背海馬神經(jīng)元TLR9基因，Rela基因缺失，Ifnar1基因缺失，并收集他們的海馬細(xì)胞。和對照組相比，基因敲除小鼠海馬組織dsDNA斷裂的神經(jīng)元數(shù)量顯著增加。值得注意的是，TLR9和Rela基因的缺失幾乎完全破壞了53BP1蛋白向DNA損傷位點的募集，也阻止了53BP1蛋白向位于中心體內(nèi)的DNA損傷修復(fù)位點的移動，提示TLR9信號在維持神經(jīng)元基因組穩(wěn)定性中的重要作用。海馬組織染色結(jié)果顯示，TLR9和Rela基因的缺失抑制了CA1神經(jīng)元中的纖毛形成，并伴隨著周圍神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)（PNNs）的消失和復(fù)雜性的下降。鑒于PNNs在穩(wěn)定記憶回路中的重要性，這表明TLR9缺失可能導(dǎo)致核內(nèi)和中心體的DNA損傷反應(yīng)受損，致使CFC刺激后的CA1神經(jīng)元無法正確召集DNA修復(fù)復(fù)合物，也無法形成纖毛和PNNs（圖4）。

綜上所述，神經(jīng)元細(xì)胞中TLR9信號的缺失會導(dǎo)致DNA損傷，影響DNA修復(fù)，并抑制神經(jīng)元纖毛的形成，還能破壞基因組的穩(wěn)定性，防止小鼠形成長期記憶。因此，維護(hù)TLR9信號通路的完整性，可能是一種有前途的神經(jīng)認(rèn)知缺陷的預(yù)防策略。

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