2024年4月10日，澳大利亞墨爾本彼得·麥卡倫癌癥中心的研究團(tuán)隊(duì)在《Nature》期刊發(fā)表了題為“FOXO1 enhances CAR T cell stemness, metabolic fitness and efficacy”的文章。該研究表明：過(guò)表達(dá)FOXO1促進(jìn)了健康人或患者的CAR-T細(xì)胞的干細(xì)胞樣表型，這與體內(nèi)線粒體適應(yīng)度、持久性和治療效果的改善有關(guān)，可以提高CAR-T細(xì)胞對(duì)抗實(shí)體瘤的療效。

CAR-T細(xì)胞可以特異性識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞療法改變了血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療，包括急性淋巴細(xì)胞白血病、B細(xì)胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤，但CAR-T細(xì)胞療法在實(shí)體瘤治療中的療效有限，無(wú)法保持足夠長(zhǎng)時(shí)間的活性，而實(shí)體瘤在所有人類癌癥中占到了90%的比例。CAR-T在慢性抗原刺激、缺乏共刺激信號(hào)等壓力下形成終末分化狀態(tài)。這種終末分化的CAR-T類似于內(nèi)源性耗竭T細(xì)胞，特點(diǎn)是低表達(dá)效應(yīng)分子而高表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子，如PD1、LAG3和TIM3。分析臨床使用的抗CD19 CAR-T細(xì)胞發(fā)現(xiàn)好的治療結(jié)果與更“干細(xì)胞樣”的表型和線粒體質(zhì)量增加有關(guān)。因此，研究者試圖確定能夠增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞適應(yīng)性和對(duì)抗實(shí)體腫瘤功效的轉(zhuǎn)錄因子。

之前有研究報(bào)道IL15刺激后的CAR-T細(xì)胞功效更長(zhǎng)，故研究者用IL15刺激CD8⁺ CAR-T，之后進(jìn)行表觀遺傳組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)Foxo1基因富集最顯著，FOXO1在表觀遺傳水平上排名也很高。FOXO1是一種轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化等過(guò)程中起重要作用。在小鼠CAR-T中用CRISPR-Cas9敲除Foxo1，CD62L和TCF7下調(diào)，且當(dāng)與E0771-HER2腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，敲除Foxo1的CAR-T中，PD1、LAG3和TIM3表達(dá)水平顯著增加。在攜帶原位E0771-HER2乳腺腫瘤或皮下注射MC38-HER2腫瘤的小鼠模型中，FOXO1、TCF7和ID3過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞的功效，并顯著增加荷瘤小鼠的存活率。（圖1）

圖1. FOXO1-ADA（FOXO1活性變體）過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞的治療效果

（文中所有圖片均來(lái)源于《Nature》雜志）

接下來(lái)，研究者研究了從治療9天的荷瘤小鼠腫瘤和引流淋巴結(jié)（dLNs）中分離的CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)表型。與對(duì)照CAR-T細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)FOXO1-ADA的CAR-T細(xì)胞，促炎細(xì)胞因子IFNγ和TNF顯著增加，但PD1和TIM3的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。IFNγ的分泌已被證明對(duì)CAR-T細(xì)胞在實(shí)體腫瘤環(huán)境中的抗腫瘤效果至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)表明，阻斷IFNγ消除了過(guò)表達(dá)FOXO1-ADA導(dǎo)致的增強(qiáng)的CAR-T細(xì)胞治療活性，表明表達(dá)FOXO1-ADA的細(xì)胞產(chǎn)生的IFNγ可能導(dǎo)致了治療效果增強(qiáng)。研究者還發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)FOXO1-ADA的CAR-T的氧化磷酸化增強(qiáng)，且荷瘤小鼠腫瘤組織內(nèi)的過(guò)表達(dá)FOXO1-ADA的CAR-T線粒體膜電位和線粒體質(zhì)量（數(shù)量和大?。┻m應(yīng)性增加。（圖2）

圖2. FOXO1-ADA過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了體內(nèi)多功能性和代謝適應(yīng)度

隨后，研究人員在人CAR-T細(xì)胞中研究FOXO1過(guò)表達(dá)效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)人CAR-T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FOXO1-ADA，CD62L⁺CD27⁺和CD45RA⁺比例增加，LAG3和TIM3表達(dá)降低，表明一種低分化干性狀態(tài)。但和小鼠CAR-T不同，過(guò)表達(dá)FOXO1-ADA的人CAR-T在激活后不能有效轉(zhuǎn)化為效應(yīng)細(xì)胞。因此，研究人員轉(zhuǎn)而使用FOXO1-WT構(gòu)建FOXO1過(guò)表達(dá)CAR-T。結(jié)果表明FOXO1-WT過(guò)表達(dá)同樣增加了CD62L⁺CD27⁺和CD45RA⁺比例，還與CCR7和CX3CR1的表達(dá)增加及CD39、TIM3和PD1的表達(dá)減少相關(guān)。為了進(jìn)一步了解FOXO1過(guò)表達(dá)CAR-T細(xì)胞更像干細(xì)胞表型的機(jī)制，研究者使用RNA-seq分析了CD8⁺和CD4⁺ CAR-T細(xì)胞。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)FOXO1的CD8⁺ CAR-T細(xì)胞中與低分化T細(xì)胞相關(guān)的基因表達(dá)增加。FOXO1過(guò)表達(dá)CD8⁺ CAR-T細(xì)胞在與Lewis Y⁺腫瘤細(xì)胞（MCF7細(xì)胞）共培養(yǎng)后，糖酵解基因的表達(dá)更高。研究者進(jìn)一步分析了非活化的CD8⁺ CAR-T細(xì)胞和活化的CD8⁺ CAR-T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)FOXO1的表達(dá)增加了具有更多干細(xì)胞樣表型的CD8⁺ CAR-T細(xì)胞的比例，其次，表達(dá)FOXO1的CAR-T細(xì)胞與低分化細(xì)胞相關(guān)的基因顯著富集，與糖酵解和耗竭相關(guān)的基因表達(dá)減少。（見(jiàn)圖3）

圖3. FOXO1過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了人CAR-T細(xì)胞的干性和代謝適應(yīng)度

為了研究體內(nèi)FOXO1過(guò)表達(dá)的影響，研究者用Lewis Y CAR-T細(xì)胞治療OVCAR-3荷瘤小鼠。結(jié)果表明，FOXO1過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞的功效，腫瘤體積顯著減少。其次，小鼠血液和脾臟中CD8⁺和CD4⁺ CAR-T細(xì)胞數(shù)量顯著增加，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的控制也顯著增強(qiáng)了。在治療后第12天，小鼠腫瘤中CD8⁺ CAR-T細(xì)胞的比例顯著增加。FOXO1過(guò)表達(dá)還顯著降低了腫瘤浸潤(rùn)性CD8⁺ CAR-T細(xì)胞上PD1和TIM3的表達(dá)，而不影響Ki67的表達(dá)。過(guò)表達(dá)TCF7不能達(dá)到同樣的效果。（見(jiàn)圖4）

圖4. 過(guò)表達(dá)FOXO1增強(qiáng)了人CAR-T細(xì)胞在小鼠腫瘤移植模型中的作用

綜上，FOXO1能增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞療效，促進(jìn)其抗腫瘤活性。這項(xiàng)研究為工程化CAR-T獲得更強(qiáng)更持久的臨床效果帶來(lái)了新的思路，未來(lái)可能可以惠及更多癌癥患者。

云克隆開(kāi)發(fā)了與該研究相關(guān)的靶標(biāo)產(chǎn)品，部分指標(biāo)節(jié)選如下：

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