生物體衰老的特征是生理完整性和適應(yīng)性的時(shí)間依賴性喪失。這一特征是由多種、重機(jī)制共同驅(qū)動(dòng)的，通過導(dǎo)致細(xì)胞損傷的積累，最終引起器官功能和組織穩(wěn)態(tài)下降。端粒功能障礙是衰老的主要標(biāo)志，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）基因的低轉(zhuǎn)錄會(huì)引起端粒酶活性不足，從而引發(fā)端粒功能障礙和衰老相關(guān)疾病。此外，TERT還作為衰老和年齡相關(guān)疾病關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)劑。然而，TERT的下游作用機(jī)制仍未得以闡明。最近，美國(guó)德克薩斯大學(xué)團(tuán)隊(duì)在《Cell》上發(fā)表了題為“TERT activation targets DNA methylation and multiple aging hallmarks”的文章。研究中，作者鑒定報(bào)道了一種TERT激活劑化合物（TAC），該化合物通過MEK/ERK/AP-1級(jí)聯(lián)上調(diào)TERT轉(zhuǎn)錄。在人的原代細(xì)胞和自然衰老高齡小鼠中，TAC誘導(dǎo)的TERT水平升高能促進(jìn)端粒合成，并能通過減少細(xì)胞衰老和炎癥細(xì)胞因子來減弱組織衰老標(biāo)志，同時(shí)通過上調(diào)甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3B介導(dǎo)的啟動(dòng)子超甲基化來沉默衰老標(biāo)志基因p16^INK4a的表達(dá)。在人腦中，TAC減輕神經(jīng)炎癥，增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，刺激成年人神經(jīng)發(fā)生，并保持認(rèn)知功能，而沒有明顯的毒性，包括癌癥風(fēng)險(xiǎn)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了TERT在衰老過程中的關(guān)鍵作用，并為TERT生理激活作為減輕多種衰老特征和相關(guān)病理的策略提供了臨床前證明。這將會(huì)對(duì)阿爾茨海默病、帕金森病等年齡相關(guān)疾病產(chǎn)生積極治療意義。

首先，研究者通過基于細(xì)胞的高通量篩選（HTS）法，以大規(guī)模篩選在成年轉(zhuǎn)基因（hTERT）小鼠耳成纖維細(xì)胞中調(diào)節(jié)人TERT轉(zhuǎn)基因體內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性的小分子。最終，通過Rluc熒光素酶報(bào)告基因的測(cè)量表征了大約100個(gè)位點(diǎn)。鑒定出了幾種能夠誘導(dǎo)TERT基因轉(zhuǎn)錄活性的TCAs。免疫印跡分析表明，篩選的TAC能誘導(dǎo)TERT蛋白的最高表達(dá)。因此選擇它進(jìn)行進(jìn)一步的分析。另外，TAC處理能誘導(dǎo)原代人成纖維細(xì)胞MRC5中TRET mRNA水平的依賴性升高。一致的是，TAC處理導(dǎo)致TERT基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游活性增強(qiáng)子/啟動(dòng)子標(biāo)記H3K27ac的積累和抑制標(biāo)記H3K9me3的缺失，表明TAC可以覆蓋調(diào)控人TERT基因座的染色質(zhì)狀態(tài)。此外，TAC能增加hTERT-Rluc轉(zhuǎn)基因小鼠的多個(gè)組織（包括腦、心臟和骨骼?。┲腥祟?em>TERT基因的表達(dá)。對(duì)原發(fā)性維爾納綜合癥（WS）成纖維細(xì)胞中TAC活性的評(píng)估結(jié)果表明，可以通過強(qiáng)制hTERT的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)這些細(xì)胞的快速衰老。且TAC（0.5mM）能夠誘導(dǎo)WS成纖維細(xì)胞中TERT的表達(dá)。在該WS模型中，定量PCR和熒光原位雜交（FISH）分析均顯示，相對(duì)于對(duì)照組，長(zhǎng)期TAC處理導(dǎo)致內(nèi)源性端粒長(zhǎng)度增加。這表明TAC/ TERT介導(dǎo)的端粒添加能有效地修復(fù)短端粒的DNA損傷，并且人原代成纖維細(xì)胞保留了增殖能力。

圖1. TERT小分子激活劑的鑒定

為了進(jìn)一步研究下游信號(hào)級(jí)聯(lián)和與TAC誘導(dǎo)TERT表達(dá)相關(guān)的TERT啟動(dòng)子原件，研究者們首先使用磷酸激酶陣列分析了激酶極其底物的磷酸化譜。發(fā)現(xiàn)在人原代MRC5細(xì)胞中，TAC處理后細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）及其下游效應(yīng)物S6激酶的磷酸化持續(xù)增加。因此，用MEK激酶抑制劑抑制ERK可消除TAC誘導(dǎo)的MRC5細(xì)胞中ERK的磷酸化和TERT上調(diào)。

接下來，他們研究了不同體細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化，以闡明將ERK激活與TERT轉(zhuǎn)錄控制聯(lián)系起來的潛在轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合元件。通過對(duì)人類正常成纖維細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）衍生神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄組分析，研究者觀察到，TAC（0.5mM, 1h）急性處理導(dǎo)致兩種人類細(xì)胞類型中只有有限數(shù)量的常見基因被顯著誘導(dǎo)。其中，FOS和SOGA3，在處理后的兩種細(xì)胞類型中都表現(xiàn)出顯著的上調(diào)。FOS編碼活化蛋白1 （AP-1）轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的主要成分，在兩種細(xì)胞中被鑒定為受TAC調(diào)控最顯著的基因。這證明TAC處理能特異性誘導(dǎo)TERT表達(dá)及其下游轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。作者同時(shí)發(fā)現(xiàn)位于人類TERT基因上4kb調(diào)控區(qū)域內(nèi)有兩個(gè)AP-1結(jié)合位點(diǎn)。隨后，作者構(gòu)建了一個(gè)包含來自TERT基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的4kb上游序列的人TERT啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告子，以探究TERT啟動(dòng)子激活是否需要AP-1基序。轉(zhuǎn)染MRC5細(xì)胞后，用TAC刺激細(xì)胞能夠誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞的TERT報(bào)告活性。且單缺失和雙缺失AP-1基序都能顯著消除TAC誘導(dǎo)的TERT啟動(dòng)子活性。染色質(zhì)免疫沉淀和實(shí)時(shí)定量PCR （ChIP-qPCR）分析顯示，TAC處理導(dǎo)致內(nèi)源性AP-1復(fù)合物亞基FOS募集到內(nèi)源性TERT啟動(dòng)子中的兩個(gè)AP-1結(jié)合基序?？傊@些數(shù)據(jù)表明，TAC通過MEK/ERK/AP-1途徑特異性激活TERT的轉(zhuǎn)錄。

圖2. TAC激活MEK/ERK/AP-1級(jí)聯(lián)，上調(diào)TERT基因轉(zhuǎn)錄

接下來，作者評(píng)估了TAC介導(dǎo)的TERT誘導(dǎo)是否能減輕端粒完好的老年小鼠的機(jī)體衰老。對(duì)12月齡小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞的RNA測(cè)序結(jié)果顯示，TAC處理的中年小鼠外周血中TERT蛋白水平顯著升高。經(jīng)過1周的治療，發(fā)現(xiàn)TAC處理組中和小鼠衰老相關(guān)的關(guān)鍵特征顯著減少。如衰老關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子p16^Ink4a以及其它和衰老相關(guān)的分泌表型（SASP）成分-IL-1α，IL-1β，Mmp-3和Vegf 等都表現(xiàn)出明顯的減少。相反，TAC處理能同時(shí)誘導(dǎo)生物體中生長(zhǎng)和自然殺傷細(xì)胞激活。而這些特征在正常小鼠中是隨著年齡增長(zhǎng)而下降的。在TERT缺失的小鼠中，TAC介導(dǎo)的p16^Ink4a抑制被消除。表明TERT對(duì)TAC誘導(dǎo)的p16^Ink4a沉默是必需的。對(duì)Tert^+/+、Tert^+/- 和Tert^-/-小鼠大腦的定量RT-PCR分析證實(shí)Tert^+/-小鼠的DNMT3b甲基化轉(zhuǎn)移酶的水平明顯下調(diào)，Tert^-/-小鼠的DNMT3b水平進(jìn)一步下調(diào)，表明TERT水平和體內(nèi)Dnmt3b表達(dá)呈正相關(guān)。相應(yīng)地，ChIP測(cè)序分析表明，TERT與DNMT3b啟動(dòng)子結(jié)合。這些結(jié)果表明，TERT不僅在高增殖細(xì)胞中，而且在終末分化細(xì)胞中也可作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑。

鑒于DNMT3b介導(dǎo)的DNA甲基化與p16^INK4a轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)，研究者們隨后探究了TAC治療是否能夠誘導(dǎo)體內(nèi)p16^InkK4a啟動(dòng)子的高甲基化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TAC治療后中年小鼠組織中p16^InkK4a啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的CpG位點(diǎn)顯著增加。此外，給予TAC治療6個(gè)月能減少老年小鼠多組織中衰老細(xì)胞的負(fù)荷，增加促炎癥因子的產(chǎn)生。因此，TAC驅(qū)動(dòng)的TERT上調(diào)減少了年齡依賴性組織衰老，并調(diào)節(jié)了細(xì)胞衰老的主要遺傳驅(qū)動(dòng)因素，包括p16^InkK4a和SASP成分。

圖3. TAC可在體內(nèi)減弱多種衰老特征

為了進(jìn)一步了解TAC對(duì)基因表達(dá)程序的影響，對(duì)中年（約12- 14月齡）C57BL/6小鼠的海馬組織進(jìn)行了RNA-seq分析，這些小鼠分別接受了載藥或TAC治療3周。值得注意的是，TAC治療誘導(dǎo)了與成人海馬神經(jīng)發(fā)生和大腦功能正相關(guān)基因的表達(dá)顯著增加。此外，通路富集分析顯示，TAC治療導(dǎo)致中年小鼠海馬突觸電位、軸突引導(dǎo)、海馬/干細(xì)胞發(fā)育、端粒維持、神經(jīng)母細(xì)胞增殖、多巴胺能神經(jīng)發(fā)生/中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元分化和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族信號(hào)級(jí)聯(lián)相關(guān)通路的激活。相反，和衰老相關(guān)的細(xì)胞因子和炎癥因子在TAC處理下都顯著下調(diào)。免疫組織化學(xué)和免疫熒光分析顯示，TAC治療4周顯著增加了海馬齒狀回（DG）中表達(dá)DXC的新生神經(jīng)元的數(shù)量。這表明TAC確實(shí)可以增強(qiáng)老年大腦的再生能力。因此，TERT的藥理激活誘導(dǎo)了與返老還童相關(guān)的基因特征，并刺激了成年小鼠海馬體中的成年神經(jīng)發(fā)生。

慢性神經(jīng)炎癥是大腦衰老的普遍特征，膠質(zhì)細(xì)胞是大腦神經(jīng)炎癥的主要參與者，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活被認(rèn)為是大多數(shù)大腦衰老和神經(jīng)退行性疾病中可見的神經(jīng)炎癥的標(biāo)志。與對(duì)照組相比，TAC給藥顯著降低了衰老小鼠大腦中IBA1陽性激活的小膠質(zhì)細(xì)胞水平。在TAC處理的海馬組織中，包括IL-1β、IL-6和TNF-α在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子的含量也相對(duì)于對(duì)照組有所減少。經(jīng)過6個(gè)月的治療，接受TAC治療的老年小鼠在三個(gè)海馬依賴性認(rèn)知測(cè)試-巴恩斯迷宮和新位置識(shí)別任務(wù)中的表現(xiàn)都有明顯改善?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明，適度的tac誘導(dǎo)內(nèi)源性TERT水平的增加不僅改善了老年小鼠海馬依賴的認(rèn)知功能，還增強(qiáng)了神經(jīng)肌肉功能，而沒有任何明顯的不良后果。

圖4. 長(zhǎng)期TAC給藥可改善大腦衰老

本研究強(qiáng)調(diào)了衰老器官系統(tǒng)的顯著再生能力，以及在自然衰老過程中藥理學(xué)調(diào)節(jié)衰老特征的能力。研究報(bào)告發(fā)現(xiàn)了一種新的小分子端粒酶激活劑TAC，該激活劑可誘導(dǎo)TERT在人和小鼠體細(xì)胞組織中的生理表達(dá)。TAC能有效地抵消成人體細(xì)胞中TERT基因的表觀遺傳沉默，從而影響控制衰老標(biāo)志的基因的表達(dá)。值得注意的是，TAC處理顯著減少了不同組織中衰老細(xì)胞的比例。同時(shí)，DNMT3B介導(dǎo)的主細(xì)胞死亡基因p16^Ink4a的抑制以TERT依賴的方式進(jìn)行。此外，在老年小鼠中長(zhǎng)期給予腦滲透TAC可減少神經(jīng)炎癥和炎癥細(xì)胞因子，增強(qiáng)與年輕化相關(guān)的基因特征，促進(jìn)成年神經(jīng)發(fā)生，并在沒有明顯副作用的情況下保持認(rèn)知功能。因此，生理TERT激活有望緩解小鼠自然衰老過程中的衰老表型。

圖5. TAC/TERT驅(qū)動(dòng)的抗衰老效果示意圖

云克隆開發(fā)了外泌體研究中涉及到的相關(guān)靶標(biāo)的蛋白、抗體以及試劑盒產(chǎn)品。靶標(biāo)及核心貨號(hào)如下，供參考：