多因子檢測技術是一種基于流式熒光法的多重檢測技術，一次實驗可同時檢測多個靶標分子，適用于蛋白質、小分子、多肽等靶標的檢測。相比傳統(tǒng)的單因子檢測方法，多因子檢測技術具有高通量、高靈敏度和特異性好的特點，同時還能節(jié)省樣本，提高檢測效率，有著廣泛的應用前景。

流式熒光法多因子檢測的免疫學原理與普通酶聯免疫吸附實驗相似，但信號檢測系統(tǒng)有所不同。多因子檢測也可以分為雙抗夾心和競爭法。雙抗夾心法是通過將已知的抗體偶聯在熒光微球表面，待測抗原與偶聯的抗體反應，加入生物素化的檢測抗體，形成雙抗夾心的結構，最后加入另一熒光素（以PE為例）標記的鏈霉親和素，PE被激發(fā)后，測定MFI值（Median Fluorescence Intensity）。MFI值的大小和樣品中的靶物質濃度呈正相關。此法多用于IL6、TNFα等大分子蛋白的檢測。

競爭法是通過將已知的抗體偶聯在熒光微球表面，加入生物素化的抗原和待測抗原，二者競爭結合熒光微球上的偶聯抗體。樣本中抗原量含量愈多，結合在微球上的生物素化抗原愈少，最后加入PE標記的鏈霉親和素，PE被激發(fā)后，測定MFI值。小分子激素、藥物等靶標的測定多用此法。

標準曲線的繪制和擬合對于多因子檢測試劑盒實驗的成功至關重要。下面我們以WPS的XLS軟件為例，介紹云克隆公司的3因子試劑盒，IS135-Multiplex Assay Kit for IL1b, IL18, BDNF的標曲擬合方法，以供參考。

  如圖1所示，實驗人員按照說明書將標準品從最高濃度（STD1），經倍比稀釋至最低濃度（STD6），陰性對照孔為標準品稀釋液（STD7）；表格的數值部分是不同濃度標準品的MFI值。圖2顯示的是IL1b、IL18、BDNF標準品不同梯度的對應的濃度。

圖1 標準品對應的MFI值

圖2 標準品對應的濃度值

  針對這3個靶標，我們分別進行標準曲線的擬合和計算。首先，將IL1b這個靶標各孔的MFI值減去陰性對照孔MFI值，得到校正后的MFI值（如圖3所示）；接著，將校正后的MFI值和相應的標準品濃度值分別取對數（以10為底），以Log₁₀（MFI）為X軸，Log₁₀（濃度值）為Y軸，作XY散點圖（如圖3所示），具體方法如下：選中數據，點擊“插入”→“圖表”，可以在窗口的右側看到圖表類型，再點擊“X Y散點圖”，然后得到一條6點曲線（如圖5所示）；接著，在該曲線中任選一點以右鍵打開，選擇“添加趨勢線格式”，圖表上便會彈出一個對話框，可在“類型”選項中選擇“多項式（P）”并將“順序”設定為2階。最后，在“選項”中勾選“顯示公式（E）”和“顯示R平方值（R）”（如圖6所示），點確定，便會出現標準曲線的對應公式及R²值（如圖7所示）。IL18和BDNF的標準曲線制備與上文所述一致。

圖3 IL1b標曲數據處理示例圖

圖4 選擇圖表

圖5 XY散點圖 

圖6 選取下圖使用的擬合方式

圖7 帶擬合公式的標曲示意圖

  競爭法多因子試劑盒的標曲擬合和雙抗法相近，不同之處在于競爭法不需要扣除空白孔MFI值。我們以LMA461Ge，Multiplex Assay Kit for Estradiol 為例進行數據處理部分的演示。如圖8所示，MFI值和相應的標準品濃度值分別取對數（以10為底），以Log₁₀（MFI）為X軸，Log₁₀（濃度值）為Y軸，作XY散點圖。后續(xù)操作和前文所述內容相同，最后可得到如圖9所示的標曲。

圖8 Estradiol 標曲數據處理示意圖

圖9 帶擬合公式的標曲示意圖

最后，我們將多因子檢測試劑盒繪制和分析標準曲線過程中常見的問題及相應的解決方案總結如下：