多因子檢測技術(shù)是一種基于流式熒光法的多重檢測技術(shù)，一次實驗可同時檢測多個靶標(biāo)分子，適用于蛋白質(zhì)、小分子、多肽等靶標(biāo)的檢測。相比傳統(tǒng)的單因子檢測方法，多因子檢測技術(shù)具有高通量、高靈敏度和特異性好的特點，同時還能節(jié)省樣本，提高檢測效率，有著廣泛的應(yīng)用前景。

流式熒光法多因子檢測的免疫學(xué)原理與普通酶聯(lián)免疫吸附實驗相似，但信號檢測系統(tǒng)有所不同。多因子檢測也可以分為雙抗夾心和競爭法。雙抗夾心法是通過將已知的抗體偶聯(lián)在熒光微球表面，待測抗原與偶聯(lián)的抗體反應(yīng)，加入生物素化的檢測抗體，形成雙抗夾心的結(jié)構(gòu)，最后加入另一熒光素（以PE為例）標(biāo)記的鏈霉親和素，PE被激發(fā)后，測定MFI值（Median Fluorescence Intensity）。MFI值的大小和樣品中的靶物質(zhì)濃度呈正相關(guān)。此法多用于IL6、TNFα等大分子蛋白的檢測。

競爭法是通過將已知的抗體偶聯(lián)在熒光微球表面，加入生物素化的抗原和待測抗原，二者競爭結(jié)合熒光微球上的偶聯(lián)抗體。樣本中抗原量含量愈多，結(jié)合在微球上的生物素化抗原愈少，最后加入PE標(biāo)記的鏈霉親和素，PE被激發(fā)后，測定MFI值。小分子激素、藥物等靶標(biāo)的測定多用此法。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和擬合對于多因子檢測試劑盒實驗的成功至關(guān)重要。下面我們以WPS的XLS軟件為例，介紹云克隆公司的3因子試劑盒，IS135-Multiplex Assay Kit for IL1b, IL18, BDNF的標(biāo)曲擬合方法，以供參考。

  如圖1所示，實驗人員按照說明書將標(biāo)準(zhǔn)品從最高濃度（STD1），經(jīng)倍比稀釋至最低濃度（STD6），陰性對照孔為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（STD7）；表格的數(shù)值部分是不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的MFI值。圖2顯示的是IL1b、IL18、BDNF標(biāo)準(zhǔn)品不同梯度的對應(yīng)的濃度。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的MFI值

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的濃度值

  針對這3個靶標(biāo)，我們分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合和計算。首先，將IL1b這個靶標(biāo)各孔的MFI值減去陰性對照孔MFI值，得到校正后的MFI值（如圖3所示）；接著，將校正后的MFI值和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度值分別取對數(shù)（以10為底），以Log₁₀（MFI）為X軸，Log₁₀（濃度值）為Y軸，作XY散點圖（如圖3所示），具體方法如下：選中數(shù)據(jù)，點擊“插入”→“圖表”，可以在窗口的右側(cè)看到圖表類型，再點擊“X Y散點圖”，然后得到一條6點曲線（如圖5所示）；接著，在該曲線中任選一點以右鍵打開，選擇“添加趨勢線格式”，圖表上便會彈出一個對話框，可在“類型”選項中選擇“多項式（P）”并將“順序”設(shè)定為2階。最后，在“選項”中勾選“顯示公式（E）”和“顯示R平方值（R）”（如圖6所示），點確定，便會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的對應(yīng)公式及R²值（如圖7所示）。IL18和BDNF的標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與上文所述一致。

圖3 IL1b標(biāo)曲數(shù)據(jù)處理示例圖

圖4 選擇圖表

圖5 XY散點圖 

圖6 選取下圖使用的擬合方式

圖7 帶擬合公式的標(biāo)曲示意圖

  競爭法多因子試劑盒的標(biāo)曲擬合和雙抗法相近，不同之處在于競爭法不需要扣除空白孔MFI值。我們以LMA461Ge，Multiplex Assay Kit for Estradiol 為例進(jìn)行數(shù)據(jù)處理部分的演示。如圖8所示，MFI值和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度值分別取對數(shù)（以10為底），以Log₁₀（MFI）為X軸，Log₁₀（濃度值）為Y軸，作XY散點圖。后續(xù)操作和前文所述內(nèi)容相同，最后可得到如圖9所示的標(biāo)曲。

圖8 Estradiol 標(biāo)曲數(shù)據(jù)處理示意圖

圖9 帶擬合公式的標(biāo)曲示意圖

最后，我們將多因子檢測試劑盒繪制和分析標(biāo)準(zhǔn)曲線過程中常見的問題及相應(yīng)的解決方案總結(jié)如下：