體外研究新法寶，類器官 ——如何跟體內(nèi)器官更類似？
來源于干細(xì)胞的類器官是模擬人類生理的重要模型，并應(yīng)用于遺傳疾病、癌癥、再生醫(yī)學(xué)等研究中。但這類類器官不包含在體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和疾病中起重要作用的特化免疫細(xì)胞。而腸道免疫功能紊亂可導(dǎo)致各種病理改變，包括持續(xù)感染和自身免疫等。雖然來源于干細(xì)胞的腸道類器官可以模擬上皮細(xì)胞的分化和功能，但由于缺乏組織特異性免疫區(qū)室，它們?cè)谀c道病理學(xué)研究中受限。為了彌補(bǔ)這類缺陷，成人或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的類器官已與血源性先天或適應(yīng)性免疫細(xì)胞共培養(yǎng)。然而，這類模型依然沒有真正的成人組織駐留淋巴細(xì)胞室。
2024年8月14日，有研究團(tuán)隊(duì)在《Nature》期刊上發(fā)表了題為“Human organoids with an autologous tissue-resident immune compartment”的文章，該研究通過上皮類器官和自體組織駐留記憶T（Autologous tissue-resident memory T，TRM）細(xì)胞的自組織形成人腸道免疫類器官（Intestinal immuno-organoids，IIOs），該研究結(jié)合IIOs和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)來研究癌癥靶向生物制品在患者中引發(fā)的腸道炎癥，發(fā)現(xiàn)炎癥與活化CD8+ T細(xì)胞群的出現(xiàn)有關(guān)，這些細(xì)胞逐漸獲得上皮內(nèi)和細(xì)胞毒性特征。研究人員通過IIOs將Rho通路確定為緩解免疫治療相關(guān)腸道炎癥的新靶點(diǎn)。
以下為研究團(tuán)隊(duì)的整體研究思路。
一、通過上皮類器官與TRM細(xì)胞的自組織形成IIOs。
該研究通過在類器官中引入TRM細(xì)胞從而引入相關(guān)淋巴細(xì)胞，因?yàn)門RM細(xì)胞永久駐留在腸黏膜中，是抵御病原體的一線防御，且TRM細(xì)胞具有記憶特性。由于人TRM細(xì)胞在酶從組織中去除后生存能力較差，研究人員采用了無酶、基于支架的抓取方案來分離腸道免疫細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示分離的細(xì)胞表達(dá)與腸道相關(guān)的TRM細(xì)胞標(biāo)志物（包括CD161和CD117），及與組織駐留和上皮細(xì)胞整合等相關(guān)的表面分子（CD69和CD103等）。研究者從人腸道樣本中生成類器官和TRM細(xì)胞，還從同一供體收集了對(duì)應(yīng)的外周血單核細(xì)胞（PBMCs）。類器官建立后，與TRM細(xì)胞或PBMCs在三維細(xì)胞外基質(zhì)中結(jié)合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：雖然PBMCs占據(jù)了細(xì)胞外基質(zhì)空間，但與上皮細(xì)胞沒有明顯的相互作用，但TRM細(xì)胞亞群浸潤(rùn)類器官在沒有刺激的情況下整合在上皮屏障內(nèi)，類似于腸道內(nèi)上皮淋巴細(xì)胞（Intestinal intraepithelial lymphocytes，IELs）的行為。（見圖1）
圖1. 腸道來源的TRM細(xì)胞可動(dòng)態(tài)整合到自體類器官中形成IIOs。
（文中所有圖片均來源于《Nature》雜志）
一、結(jié)合IIOs和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)來研究T細(xì)胞雙特異性抗體（Tcell-bispecific，TCBs）對(duì)患者腸道炎癥的影響。
為了了解TRM細(xì)胞和IELs在體外與腸上皮細(xì)胞整合的方式，該研究使用單細(xì)胞RNA測(cè)序分析了來自三種不同小腸樣本的IIO培養(yǎng)物。研究表明，單獨(dú)培養(yǎng)或在IIOs中培養(yǎng)的TRM細(xì)胞，與匹配的血源細(xì)胞不同，在轉(zhuǎn)錄組學(xué)上由以下因素定義：（1）缺乏淋巴結(jié)歸巢所需的受體（SELL、CCR7），（2）腸道歸巢和整合因子（ITGA1、CCR9、JAML）本質(zhì)上高表達(dá)，（3）完全缺乏細(xì)胞毒性顆粒（GZMB、GZMK、GNLY）。研究人員進(jìn)一步追蹤了供體匹配的腸道TRM細(xì)胞和血液T細(xì)胞，結(jié)果顯示了兩個(gè)種群在形態(tài)和遷移行為上的顯著差異。血液T細(xì)胞大部分是靜態(tài)和圓形的，但TRM細(xì)胞則呈現(xiàn)出細(xì)長(zhǎng)的形狀，并在上皮層和細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)動(dòng)態(tài)遷移。（見圖2）
圖2. 組織駐留的轉(zhuǎn)錄組特征和遷移行為是TRM細(xì)胞上皮嵌入和IIOs形成的基礎(chǔ)
接下來，研究人員測(cè)試了TRM細(xì)胞和PBMCs之間的差異轉(zhuǎn)錄組和遷移行為是否會(huì)轉(zhuǎn)化為效應(yīng)功能的差異，特別是研究了IIOs與癌癥免疫治療相關(guān)的臨床毒性及嚴(yán)重的腸道炎癥之間的關(guān)聯(lián)。研究人員選擇了solitomab（一種T細(xì)胞雙特異性抗體，抗CD3/EpCAM抗體），旨在通過上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）將活化的T細(xì)胞與實(shí)體腫瘤交聯(lián)，從而在患者中誘導(dǎo)侵襲性非故意腸道炎癥。該研究用臨床相關(guān)濃度的EpCAM靶向TCBs處理IIOs。與PBMCs培養(yǎng)的類器官不同，檢測(cè)caspase 3/7發(fā)現(xiàn)IIOs在低至40 pg/ml的濃度下以TCB劑量依賴性的方式靶向，并且在處理后8小時(shí)即可靶向。進(jìn)一步研究結(jié)果表明相對(duì)于非靶向?qū)φ眨琓CB處理誘導(dǎo)T和B細(xì)胞狀態(tài)的比例發(fā)生變化。在第4小時(shí)特別突出的是TH1樣CD4+T群體，特征是TNF和IFNG信號(hào)的快速誘導(dǎo)，隨著時(shí)間的推移而下調(diào)。在48小時(shí)，觀察到活化的CD8+ IEL群體的出現(xiàn)，表達(dá)與細(xì)胞毒性（如GZMB）、TCR信號(hào)傳導(dǎo)和T細(xì)胞遷移相關(guān)的基因。同時(shí)，出現(xiàn)了（表達(dá)MKI67的）循環(huán)CD4+T細(xì)胞群和活化的B細(xì)胞群，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群減少。且通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)scRNA-seq檢測(cè)到的關(guān)鍵基因表達(dá)變化與蛋白水平的變化一致。這些結(jié)果顯示IIO細(xì)胞異質(zhì)性動(dòng)力學(xué)與從經(jīng)歷自發(fā)和免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）誘導(dǎo)的腸道炎癥的患者中觀察到的原始樣本具有驚人的相似性。這些相似之處表明IIOs可用于體外研究腸道炎癥。（見圖3）
圖3. IIOs再現(xiàn)了與TCBs相關(guān)的臨床腸道炎癥
三、探究Rho通路對(duì)IIOs模型中炎癥的影響。
鑒于TNF阻斷抗體在自身免疫性疾病治療中的有效性，以及在模型中TNF的早期誘導(dǎo)，研究人員研究了其在促進(jìn)分化和激活中的作用。預(yù)測(cè)從IIOs中完全去除TNF將阻止TRM細(xì)胞活化。TCB治療后，在IIOs中使用阿達(dá)木單抗（adalimumab）對(duì)TNF進(jìn)行抗體中和證實(shí)了這一預(yù)測(cè)，處理后顯著降低了TRM細(xì)胞中關(guān)鍵激活和分化標(biāo)志物ICAM-1、4-1BB、CD25和Gzmb的表達(dá)。此外，在炎癥反應(yīng)中上皮表達(dá)的趨化因子CCL2顯著降低。鑒于TRM細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的快速運(yùn)動(dòng)，研究人員假設(shè)T細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)可能與炎癥關(guān)聯(lián)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，該研究使用ROCK1/2（Rho-associated protein kinase 1/2）抑制劑Y-27632來抑制TCB處理的IIOs細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。發(fā)現(xiàn)ROCK抑制比TNF阻斷更有效地減少了上皮細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制TRM細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，并誘導(dǎo)T細(xì)胞激活標(biāo)記物和細(xì)胞溶解分子，如perforin和Gzmb。細(xì)胞內(nèi)染色顯示TNF的誘導(dǎo)也被抑制，但總體T細(xì)胞活力不變。由此研究人員將Rho通路確定為緩解免疫治療相關(guān)腸道炎癥的新靶點(diǎn)。（見圖4）
圖4. 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析闡明TCB介導(dǎo)的炎癥背后的免疫動(dòng)力學(xué)
綜上，該研究使用IIOs確定了通過Rho通路阻斷TRM細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有助于抑制炎癥。由于IIOs重現(xiàn)了表型結(jié)果和介導(dǎo)它們的細(xì)胞間相互作用，由此推測(cè)，IIOs不僅可以幫助研究藥物誘導(dǎo)炎癥的的組織駐留免疫反應(yīng)，還可以助力研究包括腫瘤發(fā)生、感染性和自身免疫性疾病下的組織駐留免疫反應(yīng)。
云克隆開發(fā)了與該研究相關(guān)的靶標(biāo)產(chǎn)品，部分指標(biāo)節(jié)選如下：
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