提到ELISA實(shí)驗(yàn)，相信大家都非常熟悉。盡管ELISA實(shí)驗(yàn)操作相對簡單，但在實(shí)驗(yàn)中總會(huì)遇到或多或少的問題，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)進(jìn)展受阻，給實(shí)驗(yàn)者帶來不少困擾。今天，小云就給大家介紹一下ELISA實(shí)驗(yàn)影響因素，希望能夠?yàn)槟腅LISA實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行保駕護(hù)航。

樣本因素

樣本因素可分為內(nèi)源性影響因素和外源性影響因素。

一、內(nèi)源性影響因素

大約40%的人血清樣本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果。常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和異嗜性抗體等其他物質(zhì)等。以類風(fēng)濕因子和補(bǔ)體為例。

1） 類風(fēng)濕因子：在類風(fēng)濕患者及正常人血清中，常含有較高或不同濃度的類風(fēng)濕因子(RF)，其一般為IgM型，亦有IgG和IgA型，具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點(diǎn)，因?yàn)樵贓LISA測定中，其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標(biāo)的特異抗體IgG結(jié)合，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

2） 補(bǔ)體：在固相酶免疫測定中，來自哺乳動(dòng)物的固相抗體和酶標(biāo)二抗均有激活人補(bǔ)體系統(tǒng)的功能。一方面，固相抗體和酶標(biāo)二抗可因其吸附及結(jié)合過程中抗體分子發(fā)生變構(gòu)，使Fc段的補(bǔ)體C1q結(jié)合點(diǎn)暴露出來，使C1q成為一個(gè)中介物將二者交聯(lián)起來出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另一方面，固相抗體也會(huì)因?yàn)榛罨a(bǔ)體的結(jié)合，封閉抗體和抗原的表位結(jié)合能力而引起假陰性。

二、外源性影響因素

1） 樣本溶血：溶血樣本及混有紅細(xì)胞的血清采用ELISA法檢測易產(chǎn)生假陽性，這是由于溶血樣本中含有大量過氧化酶物質(zhì)（紅細(xì)胞或血紅蛋白中的亞鐵血紅素），在洗滌過程中往往難以完全洗脫，它可使H₂O₂釋放出原生態(tài)氧(O)，從而催化底物四甲基聯(lián)苯胺生成可溶性的有色物質(zhì)，即顯藍(lán)色，產(chǎn)生假陽性。所以嚴(yán)重溶血樣本不推薦使用。

2） 樣本受細(xì)菌污染：因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，因此，被細(xì)菌污染的樣本同溶血樣本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而出現(xiàn)假陽性而干擾測定結(jié)果。

3） 樣本保存不當(dāng)：樣本保存時(shí)間過長可能因蛋白降解或變性而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差，為克服上述干擾，ELISA測定的樣本宜為新鮮采集。如不能立即測定，1周內(nèi)測定的樣本可存放于4℃，1周后測定的樣本應(yīng)分裝低溫凍存。樣本推薦按使用量分裝以避免反復(fù)凍融，反復(fù)凍融也會(huì)導(dǎo)致蛋白降解或變性。凍存后融解的樣本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混合后再測定，但混勻時(shí)應(yīng)輕柔，不可強(qiáng)烈振蕩。

4） 抗凝劑的干擾：肝素抗凝血漿會(huì)增加OD值，EDTA、酶抑制劑（如NaN₃）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性。

5） 樣本脂肪含量過高：樣本中的脂肪含量過高，會(huì)干擾抗原抗體反應(yīng)，造成假陰性。通過冷凍高速離心處理后，高脂樣本會(huì)分層，取樣時(shí)應(yīng)避免吸取上層脂肪層，取中間澄清段進(jìn)行檢測。

6） 樣本的制備：樣本的收集時(shí)間、處理方法和保存方式都會(huì)影響ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。小云整理了樣本處理方法，供研究者參考。

酶聯(lián)免疫吸附測定實(shí)驗(yàn)（ELISA)常見樣本處理方法

http://bitrings.com.cn/topic/201804271043087152.html

酶聯(lián)免疫吸附測定實(shí)驗(yàn)（ELISA)特殊樣本處理方法

http://bitrings.com.cn/topic/201805141347467275.html

試劑因素

一、抗體的純度、親和力、滴度和特異性

抗體是ELISA測定最為核心的原料之一，抗體的品質(zhì)決定著ELISA測定的準(zhǔn)確性。選擇純度高、親和力強(qiáng)及特異性強(qiáng)的抗體，可以有效提高試劑盒的靈敏度和特異性，且能保障檢測的準(zhǔn)確性。

二、標(biāo)準(zhǔn)品定值的準(zhǔn)確性

標(biāo)準(zhǔn)品定值是定量ELISA測定最為關(guān)鍵的因素之一，其中標(biāo)準(zhǔn)品定值的準(zhǔn)確性決定了ELISA定量測定的準(zhǔn)確性。需選用純度高，穩(wěn)定性好的抗原物，并精準(zhǔn)定量，以確保ELISA定量測定的有效性。

三、標(biāo)記物的活性

ELISA反應(yīng)中常用到酶標(biāo)記物、生物素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物等。受檢樣本中靶物質(zhì)的量與固相載體上標(biāo)記物的量呈正比例或反比例關(guān)系，根據(jù)信號(hào)值（酶催化有色產(chǎn)物呈色深淺或熒光信號(hào)）進(jìn)行定性或定量分析。標(biāo)記物的活性，可放大反應(yīng)效果，從而提高ELISA測定的靈敏度。

 操作因素

    以云克隆ELISA試劑盒產(chǎn)品為例，小云整理了操作tips和Trouble shooting。

一、操作tips

1） 試劑準(zhǔn)備

① 標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋及樣本的稀釋不推薦在板孔中進(jìn)行，避免產(chǎn)生氣泡；

② 在試劑配置和樣本稀釋時(shí)，盡量避免吸取10uL以下液體，否則會(huì)造成誤差較大;

③ 用移液器吹打混勻避免產(chǎn)生氣泡，避免用力過大將試劑吹出管外；

④ 標(biāo)準(zhǔn)品、檢測液A工作液體以及檢測液B工作液體需臨用前10min配置;

⑤ 配置檢測液A/B工作液時(shí)，用微量移液器吸取對應(yīng)量檢測液A/B稀釋液，不可直接將試劑瓶中的檢測液A/B稀釋液傾倒出，否則會(huì)造成所取液體量不準(zhǔn)確;

2） 加樣

① 加樣時(shí)吸頭需垂直懸空加入，吸頭不要傾斜或接觸孔壁或孔底；

② 加不同的樣本需要更換吸頭，避免交叉污染；

③ 樣本數(shù)量較多時(shí)，需要加快加樣速度，整板加樣時(shí)間最好控制在10min內(nèi)，避免不同孔間反應(yīng)時(shí)間相差太大，造成結(jié)果不準(zhǔn)確；

④ 加入檢測液A/B工作液以及洗液可以采用多道移液器加樣，使用多道移液器加樣注意吸頭液面平齊，并垂直懸空加樣，避免加到孔外或鄰孔；

⑤ 加入不同試劑后需要更換新覆膜，避免交叉污染；

1） 溫育

① 溫育時(shí)，需蓋上覆膜；

② 溫育時(shí)，恒溫箱需提前預(yù)熱使溫度恒定至37℃；

③ 溫育時(shí)，酶標(biāo)板需平放，不要疊放或傾斜；

4） 洗滌

① 溫育結(jié)束后，取出酶標(biāo)板，撕去覆膜，注意不要用力過猛，導(dǎo)致孔內(nèi)液體濺出，污染鄰孔；

② 甩板時(shí)應(yīng)垂直，以免不同孔間液體交叉污染，甩板時(shí)盡量將孔內(nèi)液體甩干凈；

③ 使用洗板機(jī)，洗板前后，洗板機(jī)應(yīng)用去離子水清洗幾遍，洗板過程中要不時(shí)觀察洗板機(jī)針孔內(nèi)洗液的通暢狀況；

④ 無洗板機(jī)，可用多道移液器進(jìn)行洗板，洗板后需盡快進(jìn)入下一步操作，避免酶標(biāo)板空板時(shí)間過長；

5） 顯色

顯色需在37℃避光顯色，顯色過程中每隔5min觀察顏色變化，以便及時(shí)終止，顯色時(shí)間推薦控制在10-20min內(nèi)，如顏色較深，可提前終止。如顯色20min顏色梯度仍然不明顯，可延長顯色時(shí)間至30min，不要超過30min。

6） 讀數(shù)

提前打開酶標(biāo)儀預(yù)熱，加入終止液需立即450nm讀數(shù)，讀數(shù)前確?？變?nèi)無氣泡以及板底無水滴；

二、操作Trouble shooting

綜上所述，在ELISA測定中存在著各種影響檢測結(jié)果的干擾因素，要從多方面進(jìn)行分析，除試劑因素和操作因素之外，更多的應(yīng)從樣本因素方面進(jìn)行分析，并采取相應(yīng)措施排除干擾作用，以獲得正確可靠的檢測結(jié)果。